固定信號法測定原理是隨著反應進行，通過不斷添加試劑使吸光度變化在很窄范圍內，此時所測的是加試劑的量，并依此來計算物質濃度。最典型例子是以對硝基酚作為指示劑的乙酰膽堿酯酶方法，在反應過程中不斷加入堿以中和酶水解產物乙酸以維持pH不變，然后根據(jù)所加堿量計算酶含量。這一類方法由于操作費時麻煩，目前應用很少，醫(yī)|學教育網(wǎng)搜集整理但不應忘記這類方法能維持反應條件如pH的恒定性，其它如在NADH參與的反應中不斷加入NADH有助于避免底物的消耗，在一些特殊情況下可能還是有用的。