一、前言

　　以病毒為載體的預(yù)防用活疫苗是指將外源目的基因片段構(gòu)建在病毒載體中，重組后的病毒載體導(dǎo)入機(jī)體后可表達(dá)目的蛋白，目的蛋白通過(guò)刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫學(xué)反應(yīng)而達(dá)到預(yù)防某種疾病的目的。該指導(dǎo)原則適用于以病毒為載體的預(yù)防用活疫苗制品。其目的是為該類(lèi)制劑提供一個(gè)共同的原則，具體的方案應(yīng)根據(jù)這些原則，確定具體的申報(bào)內(nèi)容。其基本原則是：安全有效，質(zhì)量可控，同時(shí)應(yīng)鼓勵(lì)創(chuàng)新，促進(jìn)以病毒為載體疫苗的研究醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理。對(duì)一些新的技術(shù)路線要建立相應(yīng)的質(zhì)控要求，可有一定的靈活性，應(yīng)注意到以病毒為載體活疫苗只是處于研究的初級(jí)階段，而且與常規(guī)生物制品相比有其本身的特點(diǎn)，需要不斷的積累經(jīng)驗(yàn)。為此，申請(qǐng)者應(yīng)加強(qiáng)咨詢(xún)和論證，提出一個(gè)確保安全有效而又適合實(shí)際的申報(bào)資料。同時(shí)，對(duì)每個(gè)方案中各個(gè)階段的操作過(guò)程、中間及最終產(chǎn)品的制備，務(wù)必制訂標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，并予嚴(yán)格實(shí)施。

　　二、疫苗構(gòu)建的基本要求

　　（一）國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀、立題依據(jù)和目的及預(yù)期效果

　　1.應(yīng)了解所預(yù)防或治療疾病的流行情況、疾病的危害程度等；包括國(guó)內(nèi)及國(guó)外對(duì)該類(lèi)疾病的預(yù)防和治療手段。

　　2.應(yīng)了解國(guó)內(nèi)外同類(lèi)產(chǎn)品研究和開(kāi)發(fā)等情況，其中包括所用的DNA載體、目的基因片段、生產(chǎn)工藝、臨床前試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的結(jié)果及進(jìn)展，以及該類(lèi)產(chǎn)品所面臨的主要問(wèn)題。

　　3.對(duì)研制該類(lèi)DNA制品用于預(yù)防疾病的有效性、安全性及必要性進(jìn)行分析。

　　4.應(yīng)對(duì)該方案與國(guó)外內(nèi)已批準(zhǔn)的或正在進(jìn)行的方案的不同之處、特點(diǎn)及其優(yōu)越性等進(jìn)行分析。凡屬新的方案，應(yīng)提供其優(yōu)越性及安全性的依據(jù)。

　　5.利益風(fēng)險(xiǎn)比。根據(jù)該預(yù)防方案可能達(dá)到的效果及可能出現(xiàn)的副作用或危害，對(duì)總體的利弊權(quán)衡的進(jìn)行評(píng)價(jià)，并提出擬采取避免或減少其危害性或副作用的措施。這種評(píng)價(jià)將是該方案能否獲得批準(zhǔn)的重要依據(jù)之一。

　　（二）病毒載體及宿主細(xì)胞的有關(guān)內(nèi)容

　　1.目前所用的病毒載體主要包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體以及痘苗病毒載體等。為此，應(yīng)明確病毒載體的來(lái)源、結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行必要的專(zhuān)利查詢(xún)，其中包括載體DNA的限制性?xún)?nèi)切酶圖譜。若有特殊的元件，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子以及PolyA位點(diǎn)等，應(yīng)提供詳細(xì)資料。若改變結(jié)構(gòu)（如丟失片段或插入片段），須對(duì)相應(yīng)片段進(jìn)行測(cè)序分析。若屬新的或改變結(jié)構(gòu)的病毒載體，須對(duì)組建的材料、方法、組建步驟及鑒定進(jìn)行詳細(xì)的研究。

　　2.生產(chǎn)用細(xì)胞：來(lái)源、傳代歷史以及質(zhì)控的材料。包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)、染色體組型、支原體、細(xì)菌、病毒等外源因子的檢測(cè)結(jié)果。若需用其它輔助病毒，須明確來(lái)源、分離的方法步驟等。

　　（三）目的基因

　　1.明確目的基因來(lái)源的病原體及其它相關(guān)生物分子的基因序列及結(jié)構(gòu)，并與我國(guó)主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性進(jìn)行分析以及明確其血清型、基因型和亞型，對(duì)該種基因型或血清型的流行情況進(jìn)行分析，若存在不同的血清型或基因型，應(yīng)對(duì)所選擇的血清型或基因型與其它血清型或基因型交叉反應(yīng)或交叉保護(hù)性進(jìn)行分析和研究。

　　2.對(duì)目的基因的序列、大小、來(lái)源以及表達(dá)產(chǎn)物的預(yù)計(jì)大小進(jìn)行分析；醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理明確目的基因選擇的依據(jù)以及其表達(dá)蛋白在防中的作用。

　　3.若對(duì)目的基因進(jìn)行了修飾，應(yīng)對(duì)其修飾后的基因序列以及修飾后基因與人類(lèi)已知基因序列的同源性進(jìn)行分析。若在表達(dá)的目的重組蛋白以外有其它氨基酸寡肽同時(shí)表達(dá)時(shí)，應(yīng)對(duì)寡肽的作用和選擇的依據(jù)進(jìn)行分析。并對(duì)基因修飾或重組的利弊權(quán)衡進(jìn)行分析。

　?。ㄋ模┲亟M病毒的構(gòu)建及種子細(xì)胞庫(kù)的建立

　　1.應(yīng)對(duì)穿梭質(zhì)粒與目的基因連接的詳細(xì)步驟進(jìn)行研究，并對(duì)構(gòu)建以后的重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行檢定和確證。對(duì)重組穿梭質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增和純化條件進(jìn)行研究。

　　2.對(duì)目的基因片段導(dǎo)入病毒的過(guò)程進(jìn)行研究，建立切實(shí)可行的篩選和確證的方法。對(duì)含有目的基因片段的重組病毒的特征進(jìn)行分析。

　　3.對(duì)重組病毒的特性進(jìn)行檢定，必要時(shí)進(jìn)行序列分析，研究必要的控制元件和選擇標(biāo)記基因有無(wú)變異以及對(duì)插入的目的基因序列進(jìn)行分析，檢查有無(wú)變異。

　　4.應(yīng)當(dāng)對(duì)重組病毒感染細(xì)胞條件進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)重組病毒的的濃度、含量等進(jìn)行分析。對(duì)重組的保存條件以及穩(wěn)定性進(jìn)行研究。應(yīng)當(dāng)建立重組病毒庫(kù)。應(yīng)對(duì)重組病毒庫(kù)的外源因子進(jìn)行分析。

　　5.產(chǎn)病毒的種子細(xì)胞庫(kù)的組建：由病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞或非包裝細(xì)胞所組建的能復(fù)制并產(chǎn)生病毒的細(xì)胞系稱(chēng)為產(chǎn)病毒細(xì)胞系，即原始種子細(xì)胞庫(kù)。該原始種子細(xì)胞庫(kù)的組建過(guò)程必須予以詳細(xì)說(shuō)明，包括材料、方法、步驟、細(xì)胞系的鑒定。其中應(yīng)當(dāng)包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)、染色體組型、傳代次數(shù)、穩(wěn)定性、病毒滴度的檢測(cè)、病毒介導(dǎo)目的基因的表達(dá)活性以及外源因子的檢查等。

　　6.復(fù)制型病毒的檢測(cè)：包括方法、技術(shù)可靠性及結(jié)果

　　（五）對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的分析

　　1.將重組病毒感染合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，對(duì)感染條件進(jìn)行優(yōu)化。

　　2.建立對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的分析方法，包括表達(dá)產(chǎn)物的大小、特征等。

　　3.建立對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)反應(yīng)的特征進(jìn)行分析的方法。

　　三、生產(chǎn)工藝

　?。ㄒ唬┕ぷ骷?xì)胞庫(kù)的建立及質(zhì)控：須明確工作細(xì)胞擴(kuò)增的方法、傳代次數(shù)、倍增時(shí)間、可允許的傳代次數(shù)（保持同樣的病毒滴度及轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的活性）及工作細(xì)胞庫(kù)的規(guī)模、保存條件。并對(duì)以下內(nèi)容進(jìn)行研究：

　　1.細(xì)胞的均一性：包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)、染色體組型、表型、導(dǎo)入基因的存在狀態(tài)及其表達(dá)。

　　2.病毒滴度

　　3.轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的活性

　　4.外源因子的檢測(cè)結(jié)果

　　5.復(fù)制病毒的檢測(cè)

　　所有以上的項(xiàng)目在自檢的基礎(chǔ)上，均須由中國(guó)藥品生物制品檢定所檢定或由國(guó)家藥品監(jiān)督管理局指定的單位檢定。

　?。ǘ┓N子細(xì)胞培養(yǎng)方法和擴(kuò)增的步驟進(jìn)行優(yōu)化，建立培養(yǎng)過(guò)程中的質(zhì)控指標(biāo)。

　　（三）對(duì)重組病毒的分離、富集及純化的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并建立相應(yīng)的質(zhì)控指標(biāo)。

　　（四）對(duì)原液的稀釋分裝的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并建立質(zhì)控指標(biāo)醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理。

　?。ㄎ澹┨砑游锏馁|(zhì)控：在細(xì)胞培養(yǎng)、制備過(guò)程中使用血清、生長(zhǎng)因子、抗菌素等時(shí)，應(yīng)對(duì)去除該類(lèi)添加物的過(guò)程及效果進(jìn)行研究。并應(yīng)對(duì)保存液成份應(yīng)進(jìn)行安全性研究。

　　四、制品的藥理、毒理學(xué)研究

　?。ㄒ唬┌踩栽囼?yàn)

　　1.復(fù)制型病毒的檢測(cè)，應(yīng)嚴(yán)格檢查復(fù)制型病毒并制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。

　　2.特種添加物：除細(xì)胞培養(yǎng)及保存所用的試劑外，如使用明膠、縫線或金屬粒子等其它添加物，應(yīng)對(duì)此類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行動(dòng)物安全性研究。

　　3.分子遺傳學(xué)的評(píng)估：應(yīng)對(duì)目的基因在體內(nèi)的存在狀態(tài)以及分布情況進(jìn)行研究。

　　4.目前用于載體的病毒有疫苗株和非疫苗株，對(duì)非疫苗株應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的安全性研究。

　?。ǘ┒纠矸磻?yīng)的評(píng)估

　　這也是安全性試驗(yàn)的重要組成部分。除目的基因可能導(dǎo)致的毒性外，導(dǎo)入系統(tǒng)的安全性評(píng)價(jià)至為重要，其安全性評(píng)估應(yīng)包括急性毒性（最大耐受量）及長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。毒性試驗(yàn)所用的劑量，除包括相當(dāng)于臨床使用劑量（按體重或表面積計(jì)算）外，尚需有一個(gè)較大的劑量。給藥途徑應(yīng)盡可能模擬臨床給藥或?qū)氲男问?。若改變途徑須說(shuō)明其原因及依據(jù)。毒性反應(yīng)的觀察，除常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目外，應(yīng)包括其它相關(guān)的檢測(cè)指標(biāo)。還應(yīng)對(duì)局部刺激進(jìn)行研究。

　?。ㄈ┟庖邔W(xué)的評(píng)估

　　應(yīng)注意進(jìn)入體內(nèi)后的免疫反應(yīng)有關(guān)的問(wèn)題，包括過(guò)敏反應(yīng)、排斥反應(yīng)以及機(jī)體的自身免疫反應(yīng)等。應(yīng)對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行研究并提出相應(yīng)的監(jiān)控及處理措施。

　　五、質(zhì)量控制及檢定的要求

　?。ㄒ唬┥a(chǎn)過(guò)程中質(zhì)量監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)的建立及要求

　　在生產(chǎn)工藝的各個(gè)環(huán)節(jié)和步驟中對(duì)其產(chǎn)品均應(yīng)建立相應(yīng)的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，以便后續(xù)工藝的進(jìn)行。由于各申報(bào)者所選擇的工藝不同，所制定的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)和在何步驟進(jìn)行監(jiān)控可能不同，但其原則是保證產(chǎn)品的質(zhì)量、工藝的連續(xù)性和穩(wěn)定性。

　　（二）產(chǎn)品的質(zhì)量檢定與要求

　　1.外觀檢查：根據(jù)樣品的特征建立外觀檢查的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

　　2.pH值檢測(cè)，可根據(jù)一般生物制品的要求建立標(biāo)準(zhǔn)，一般為7.2±0.5.

　　3.鑒別實(shí)驗(yàn)，主要包括對(duì)病毒載體的鑒別和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的鑒別試驗(yàn)，對(duì)病毒載體的鑒別主要通過(guò)免疫學(xué)方法檢測(cè)病毒蛋白、檢測(cè)病毒核酸的大小或限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)重組病毒的核酸進(jìn)行酶切分析。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的分析主要用免疫反應(yīng)檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物和用PCR方法檢測(cè)插入基因。

　　4.建立適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)病毒的滴度及含量進(jìn)行檢測(cè)。

　　5.體外效力實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)其體外表達(dá)量，需建立定量檢測(cè)表達(dá)抗原的方法以及表達(dá)抗原的定量標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)該檢測(cè)方法的敏感性以及定量的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證；還應(yīng)檢測(cè)表達(dá)抗原的圖譜，其各表達(dá)目的抗原的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)大小相同，應(yīng)建立相應(yīng)的方法并進(jìn)行驗(yàn)證。制定各表達(dá)抗原的量和圖譜的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

　　6.建立適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)復(fù)制型病毒，并制定相應(yīng)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

　　7.無(wú)菌實(shí)驗(yàn)：應(yīng)檢測(cè)需氧菌、厭氧菌以及支原體等，制品中應(yīng)無(wú)該類(lèi)微生物的污染。

　　8.熱原試驗(yàn)：主要檢測(cè)制品中有無(wú)熱原物質(zhì)，可用鱟試劑檢測(cè)細(xì)菌的內(nèi)毒素，并制定相應(yīng)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

　　9.異常毒性實(shí)驗(yàn)：主要用小鼠和豚鼠進(jìn)行試驗(yàn)，一般小鼠腹腔接種一個(gè)人用劑量，豚鼠接種5個(gè)人用劑量。該試驗(yàn)是控制該類(lèi)制品質(zhì)量的重要指標(biāo)，由于該制品與一般生物制品相比又有其特殊性，應(yīng)根據(jù)病毒的特征建立不同的病毒特異性毒性反應(yīng)，如可將以痘苗病毒為載體的制劑接種在兔背皮下觀察肪性反應(yīng)。

　　10.屬逆轉(zhuǎn)錄病毒的導(dǎo)入系統(tǒng)，應(yīng)特別注意復(fù)制型病毒的檢測(cè)。檢測(cè)范圍，包括前述種子細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)及最后病毒制品。細(xì)胞上清液的取樣應(yīng)相當(dāng)于培養(yǎng)上清液的5%.細(xì)胞須用共培養(yǎng)法，產(chǎn)病毒細(xì)胞取樣量須達(dá)到每批中1%.檢測(cè)方法，須用S+/L-法、標(biāo)記挽救法或RT/PCR中的兩種方法。必須用陽(yáng)性對(duì)照（COS4070A上清液）及陰性對(duì)照作嚴(yán)格定量標(biāo)化，證明其敏感性及可靠性。PCR應(yīng)利用放射同位素雜交或同樣敏感的系統(tǒng)。

　　11.若最終制品為腺病毒，須補(bǔ)充以下資料：

　?。?）腺病毒顆粒數(shù)及感染單位的測(cè)定：目前公認(rèn)的腺病毒的定量，是腺病毒顆粒測(cè)定，以腺病毒基因組DNA定量為依據(jù)，以1個(gè)OD260單位作為1.11012顆粒；同時(shí)要測(cè)定感染滴度。

　?。?）復(fù)制型腺病毒的檢測(cè)：參考美國(guó)FDA1996的建議，在一個(gè)病人用的腺病毒的總量中，復(fù)制病毒不超過(guò)1個(gè)PFU.在整個(gè)制備過(guò)程中，從種子細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)的建立以及以后制備用于臨床的病毒制劑，均需檢測(cè)復(fù)制型腺病毒。檢測(cè)必須有陽(yáng)性對(duì)照，感染分子比率（MOI）在10～100之間（過(guò)高M(jìn)OI可抑制復(fù)制型病毒的生長(zhǎng)）。

　　12.對(duì)殘余宿主細(xì)胞的蛋白進(jìn)行檢測(cè)并建立質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理。

　　13.生物效價(jià)：應(yīng)評(píng)價(jià)其體液免疫和細(xì)胞免疫的生物效價(jià)。在評(píng)價(jià)體液免疫效價(jià)時(shí)，應(yīng)選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品系，建立檢測(cè)動(dòng)物血清抗體的方法，并對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證，可以計(jì)算小鼠ED50以及抗體產(chǎn)生的滴度，如有必要和可行，還應(yīng)當(dāng)建立評(píng)價(jià)抗體質(zhì)量的方法，對(duì)抗體的質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)；在評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫效價(jià)時(shí)，應(yīng)當(dāng)建立檢測(cè)評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫的方法（如特異性CTL反應(yīng)的方法或Elispot方法等），也可通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子的定量檢測(cè)評(píng)價(jià)其細(xì)胞免疫情況，如屬于常規(guī)檢定項(xiàng)目，該類(lèi)方法應(yīng)穩(wěn)定、重復(fù)性好、可操作性強(qiáng)，并制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

　　若已有蛋白類(lèi)疫苗，其評(píng)價(jià)方法應(yīng)參照有關(guān)蛋白類(lèi)疫苗的評(píng)價(jià)方法。

　　若有動(dòng)物模型，可進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。

　　14.佐劑或呈遞物質(zhì)的質(zhì)量評(píng)價(jià)：如在最終重組DNA制品含有佐劑或呈遞物質(zhì)，則應(yīng)建立檢測(cè)該類(lèi)物質(zhì)的量以及與重組DNA結(jié)合率的方法，并制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

　　15.添加物的質(zhì)控：添加物指細(xì)胞培養(yǎng)、制備過(guò)程中所用的血清、生長(zhǎng)因子等。應(yīng)建立檢測(cè)添加物的方法和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

　　六、臨床研究用樣品要求

　　（一）對(duì)申請(qǐng)I期臨床試驗(yàn)的申報(bào)者，應(yīng)在GMP條件下至少生產(chǎn)一批產(chǎn)品，其每批產(chǎn)量一般不少于1000人份。

　?。ǘ┊a(chǎn)品必須由中國(guó)藥品生物制品檢定所進(jìn)行質(zhì)量復(fù)核醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理。

　?。ㄈ┩瓿擅科谂R床研究后需及時(shí)總結(jié)材料并報(bào)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局申請(qǐng)后續(xù)的臨床試驗(yàn)。若效果明確，可以進(jìn)行III期臨床試驗(yàn)。申報(bào)者應(yīng)當(dāng)在GMP和正常規(guī)?；a(chǎn)的條件下，并由中國(guó)藥品生物制品檢定所或國(guó)家藥品管理局確定的藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)量復(fù)核。