基本要求：

　　1. 掌握與DNA復制、DNA損傷與修復、逆轉錄過程有關的基本概念。包括：半保留復制，半不連續(xù)復制，復制叉，復制子，岡崎片段，領頭鏈，隨從鏈，端粒，端粒酶等。

　　2. 掌握復制的過程，以及復制過程中涉及到的各種酶、蛋白因子；并掌握原核生物與真核生物復制的相同點與不同點。

　　3. 掌握逆轉錄過程，熟悉逆轉錄酶的應用。

　　4. 了解引起地中海貧血和鐮形紅細胞貧血的分子機制。

　　重點：DNA分子在生物體內的合成有三種方式：（1）DNA指導的DNA合成，也稱復制，是細胞內DNA最主要的合成方式。遺傳信息儲存在DNA分子中，細胞增殖時，DNA通過復制使遺傳信息從親代傳遞到子代。（2）修復合成，即DNA受到損傷（突變）后進行修復，需要進行局部的DNA的合成，用以保證遺傳信息的穩(wěn)定遺傳。（3）RNA指導的DNA合成，即反轉錄合成，是RNA病毒的復制形式，以RNA為模板，由逆轉錄酶催化合成DNA。真核生物的DNA合成過程與原核生物基本相似，但機理尚不十分清楚，以原核生物為例介紹其復制過程。

　　難點：DNA的雙螺旋結構是復制的結構基礎。DNA復制的實質為酶催化的脫氧核糖核苷酸的聚合反應。復制開始時，親代雙鏈DNA分子解開，分別作為模板，在DNA依賴的DNA聚合酶催化下，按照堿基配對的原則，將四種脫氧核苷酸連接成DNA大分子，合成產(chǎn)物的堿基序列與模板DNA的堿基序列是互補的，子代DNA雙鏈分子中，一條來自親代的模板鏈，另一條為新合成的鏈，故稱半保留復制，是生物體最主要的DNA合成方式；合成過程中，自5’→3’連續(xù)合成一條領頭鏈，不連續(xù)地合成一些片斷，而后連成一條隨從鏈，所以DNA合成是半不連續(xù)合成。反應過程復雜，首先螺旋松弛，雙鏈打開，形成復制叉，然后復制的引發(fā)，包括合成引物，形成引發(fā)體，最后是DNA鏈的延長與終止。每一階段需要有許多酶和蛋白因子參與，包括拓撲異構酶，用于理順解鏈過程中造成的鏈的盤繞、打結等現(xiàn)象；解螺旋酶在蛋白因子的輔助下結合于復制起始點，并打開雙鏈，由單鏈結合蛋白穩(wěn)定解開的兩股單鏈；引物酶及其它輔助蛋白因子在打開的雙鏈上催化合成引物，由引物提供3’-OH，與原料dNTP的5’-P形成磷酸二酯鍵，然后DNA聚合酶催化這一聚合反應的進行，而DNA連接酶將復制中的不連續(xù)片段連接成完整的鏈。真核生物的復制與原核生物相比，為多個起始點、5種DNA聚合酶以及有端粒復制等特點。

　　一、DNA的復制

　　基本要求：

　　1. 掌握復制叉、半不連續(xù)復制、岡崎片段、領頭鏈、隨從鏈等基本概念。

　　2. 掌握拓撲異構酶、解螺旋酶、單鏈結合蛋白、引物酶、DNA聚合酶、DNA連接酶的特點及生物學作用。

　　3. 熟悉DNA的合成過程。

　　4. 了解半保留復制的實驗依據(jù)。

　　基本概念：

　　1. 中心法則：遺傳信息從DNA通過轉錄流向RNA，RNA通過翻譯指導合成蛋白質，這種遺傳信息的傳遞規(guī)律稱之。少數(shù)RNA也是遺傳信息的貯存者，RNA能逆轉錄為DNA，是對中心法則的補充。

　　2. 復制（replication）：即DNA的生物合成，以DNA為模板指導合成相同的DNA分子，使遺傳信息從親代傳遞到子代的過程。RNA病毒的遺傳信息儲存于RNA分子中，可進行RNA復制并反轉錄合成DNA。

　　3. 半保留復制（semiconservative replication）：DNA復制時，親代DNA雙螺旋結構解開，分別以解開的兩股單鏈為模板，以dNTP(dATP、 dGTP 、dTTP 、dCTP)為原料，按照堿基互補的原則，合成與模板鏈互補的新鏈，從而形成兩個子代DNA雙鏈，其結構與親代DNA雙鏈完全一致。因子代DNA雙鏈中的一股單鏈源自親代，另一股單鏈為合成的新鏈，形成的雙鏈與親代雙鏈的堿基序列完全一致，故稱為半保留復制。

　　4. 復制叉（replication fork）：原核生物DNA的復制從單一起點開始，雙螺旋結構被打開，分開的兩股單鏈分別作為新DNA合成的模板，DNA合成從起點開始向兩個方向進行，與單一起點相連的局部結構形狀呈“Y”型，稱復制叉結構。

　　5. 半不連續(xù)復制：復制過程中，催化DNA 合成的DNA聚合酶只能催化核苷酸從5’→3’方向合成，以3’→ 5’鏈為模板時，新生的DNA以5’→3’方向連續(xù)合成；而以5’→3’為模板只能合成若干反向互補的岡崎片段，這些片段再相連成完整的新鏈，故稱半不連續(xù)復制。

　　6. 岡崎片段（Okazaki fragments）：DNA雙鏈是反向平行的，復制時，親代雙鏈DNA在復制叉處打開，由于新鏈的合成具有方向性，即從5’→3’，以5’→3’DNA鏈為模板合成反向互補的新鏈時，只能合成小片段DNA，這些片段根據(jù)發(fā)現(xiàn)者命名為岡崎片斷。

　　7. 領頭鏈、隨從鏈：DNA雙鏈是反向的，復制時，兩股鏈均作為模板，但新鏈的合成只能是5’→3’。因此，順著解鏈方向合成的子鏈，復制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為領頭鏈，另一股新鏈的復制方向與解鏈方向相反，復制是不連續(xù)進行的，這條不連續(xù)合成的鏈稱為隨從鏈。

　　8. 引發(fā)體：是由DnaA蛋白、DnaB蛋白（解螺旋酶）、DnaC蛋白、引物酶和DNA的起始復制區(qū)域共同形成的一個復合結構。DnaA蛋白辨認復制起始點，DnaB蛋白有解螺旋作用，DnaC蛋白使DnaB蛋白組裝到復制起始點，引物酶合成引物。

　　（一）、原核生物DNA的復制

　　1．與復制有關的酶及蛋白質：

　?。?）拓撲異構酶：通過切斷并連接DNA雙鏈中的一股或雙股，改變DNA分子拓撲構象，避免DNA分子打結、纏繞、連環(huán)，在復制的全程中都起作用。其種類有：拓撲異構酶I和拓撲異構酶II，拓撲異構酶I能切斷DNA雙鏈中一股并再連接斷端，反應不需ATP供能；拓撲異構酶II能使DNA雙鏈同時發(fā)生斷裂和再連接，需ATP供能，并使DNA分子進入負超螺旋。

　?。?） 解螺旋酶： DNA進行復制時，需親代DNA的雙鏈分別作模板來指導子代DNA分子的合成，解螺旋酶可以將DNA雙鏈解開成為單鏈。大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的解螺旋酶為DnaB。

　　（3） 單鏈結合蛋白（SSB）：在復制中模板需處于單鏈狀態(tài)，SSB可以模板的單鏈狀態(tài)并保護模板不受核酸酶的降解。隨著DNA雙鏈的不斷解開，SSB能不斷的與之結合、解離。

　?。?） 引物酶： 是一種RNA聚合酶，在復制的起始點處以DNA為模板，催化合成一小段互補的RNA。DNA聚合酶不能催化兩個游離的dNTP聚合反應，若沒有引物就不能起始DNA合成。引物酶能直接在單鏈DNA模板上催化游離的NTP合成一小段RNA，并由這一小段RNA引物提供3’-OH， 經(jīng)DNA聚合酶催化鏈的延伸。

　?。?） DNA聚合酶：是依賴DNA的DNA聚合酶，簡稱為DNA pol，以DNA為模板，dNTP為原料，催化脫氧核苷酸加到引物或DNA鏈的3’-OH末端，合成互補的DNA新鏈，即5’→3’聚合活性。原核生物的DNA聚合酶有DNA polI、DNA pol II和DNA pol III，DNA pol III是復制延長中真正起催化作用的，除具有5’→3’聚合活性，還有3’→ 5’ 核酸外切酶活性和堿基選擇功能，能夠識別錯配的堿基并切除，起即時校讀的作用；DNA pol I具有5’→3’聚合活性、3’→ 5’和5’→3’核酸外切酶活性，5’→3’核酸外切酶活性可用于切除引物以及突變片段，起切除、修復作用。另外，klenow片斷是DNA pol I體外經(jīng)蛋白酶水解后產(chǎn)生的大片段，具有DNA 聚合酶和3’→ 5’外切酶活性，是分子生物學的常用工具酶。DNA pol II 在無DNA pol I和DNA pol III時起作用，也具有5’→3’和3’→ 5’ 核酸外切酶活性。

　?。?） DNA連接酶：DNA連接酶用于連接雙鏈中的單鏈缺口，使相鄰兩個DNA片段的3’-OH末端和5’-P末端形成3’,5’磷酸二酯鍵。DNA連接酶在DNA復制、修復、重組、剪接中用于縫合缺口，是基因工程的重要工具酶。

　　2．DNA的合成過程：可將復制過程分為起始、延長和終止三個階段。

　　復制起始：

　　（1） 辨認起始點，合成引發(fā)體：在E.coli，復制起始點稱為oriC，具有特定結構能夠被DnaA蛋白辨認結合，DnaB蛋白具有解螺旋作用，DnaC蛋白使DnaB蛋白結合于起始點，DNA雙鏈局部被打開，引物酶及其他蛋白加入，形成引發(fā)體。

　?。?） 形成單鏈：DNA進行復制時，首先在拓撲異構酶作用下，使分子的超螺旋構象變化，然后在解鏈酶的作用下，解開雙鏈，才能開始進行DNA的合成。解螺旋酶在蛋白因子的輔助下打開DNA雙鏈，單鏈結合蛋白SSB結合于處于單鏈狀態(tài)模板鏈上；拓撲異構酶使DNA分子避免打結、纏繞等，在復制全過程中起作用。

　?。?） 合成引物：引發(fā)體中的引物酶催化合成RNA引物，由引物提供3’-OH基，使復制開始進行。領頭連和隨從鏈均由引物酶合成引物，隨從鏈在復制中需多次合成引物。

　　復制延長：

　　（1） 復制方向：原核生物如E.coli，只有一個起始點oriC，兩個復制叉同時向兩個方向進行復制，稱為雙向復制。

　?。?） 鏈的延長：按照與模板鏈堿基配對的原則，在DNA聚合酶III的作用下，逐個加入脫氧核糖核酸，使鏈延長。由于DNA雙鏈走向相反，DNA聚合酶只能催化核苷酸從5’→3’方向合成，領頭鏈的復制方向與解鏈方向一致，可以連續(xù)復制，而另一股模板鏈沿5’→3’方向解開，隨從鏈的復制方向與解鏈方向相反，復制只能在模板鏈解開一定長度后進行，因此隨從鏈的合成是不連續(xù)的，形成的是若干個岡崎片段。DNA聚合酶I的即時校讀，DNA聚合酶III的堿基選擇功能，使復制具有保真性。

　　復制終止：

　　原核生物如E.coli，他的兩個復制叉的匯合點就是復制的終點。由RNA酶切去領頭鏈和隨從鏈中的引物，引物留下的空隙由DNA聚合酶I催化，四種脫氧核糖三磷酸為原料自5’→3’方向延長填補。最后，DNA連接酶由ATP供能，將兩個不連續(xù)片段相鄰的5’-P和3’-OH連接起來，成為連續(xù)的子鏈，復制完成。

　　（二）、真核生物的復制：

　　真核細胞的一生可以定義為一個細胞周期，細胞增殖時， DNA通過復制使其含量成倍增加，隨后細胞分裂，成為兩個子代細胞，DNA將親代的特征傳遞到子代。細胞周期包括G1期、S期、G2期和M期， DNA的復制只發(fā)生在S期。與原核生物相比，真核生物的復制具有以下特點：

　　1. 多復制子：真核生物的DNA復制也是半保留復制。染色體線性分子的復制有多個起始點，每個起始點由兩個反向運動的復制叉組成，進行雙向復制。由一個起始點控制的DNA復制稱為一個復制子。

　　2. 5種DNA聚合酶：與原核生物不同，真核細胞含有5種DNA聚合酶：α、β、γ、δ和ε。除了γ外，所有DNA聚合酶存在于核內。DNA聚合酶α和δ在復制延長中起催化作用，DNA聚合酶α延長隨從鏈，DNA聚合酶δ延長領頭鏈。DNA聚合酶β和ε在復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作用。DNA聚合酶γ在線粒體中，用于線粒體DNA的復制。

　　3. 端粒復制：真核生物染色體線性分子的復制，領頭鏈可連續(xù)完整復制，而隨從鏈3’端引物除去后的空隙無法填補，會造成縮短了的子代的雙鏈，解決的途徑是用端粒酶來復制染色體的末端（端粒）。端粒是染色體末端具有特定重復序列和蛋白質的結構，端粒酶是一種逆轉錄酶，由酶和含重復序列的RNA分子組成，它以自身的RNA分子為模板從隨從鏈的3’端合成端粒的重復序列，使隨從鏈延長，以防止隨從鏈在每次復制時被縮短。

　　二、DNA的修復合成

　　受環(huán)境理化因素或生物學因素的影響，DNA序列會發(fā)生改變，包括堿基的變化、鏈的斷裂、交聯(lián)等，通過一定的修復機制對損傷DNA進行校正，保證遺傳信息的穩(wěn)定。

　　基本要求：

　　1． 掌握DNA突變的概念及突變類型。

　　2． 掌握損傷DNA的修復機制。

　　3． 了解突變的意義及引起突變的因素。

　　4． 了解引起地中海貧血和鐮形紅細胞貧血的分子機制。

　　基本概念：

　　1． 突變：是指DNA分子中堿基序列的改變，從而影響其表達產(chǎn)物的結構與功能。

　　2． 框移突變：基因編碼區(qū)域插入或缺失堿基，DNA分子三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，使轉錄翻譯出的氨基酸排列順序發(fā)生改變，稱為框移突變。3個或3n個堿基插入或缺失，不一定引起框移突變。

　　3． 切除修復：是最重要的修復方式，由UvrA、UvrB、UvrC、DNA-pol I、dNTP、連接酶參與。首先UvrA、UvrB辨認損傷部位并與之結合，UvrC切除損傷的DNA，DNA-pol I以dNTP為原料，填補切除空隙，最后由連接酶連接缺口，完成修復。

　　（一） 突變類型：

　　1． 點突變：又稱錯配。DNA分子中一個堿基的變異，包括轉換和顛換。

　　2． 缺失：DNA分子中一個核苷酸或一段核苷酸的消失。

　　3． 插入：一個核苷酸或一段核苷酸插入到DNA分子中。

　　4． 重排：DNA鏈內部重組，使其中一段方向反置或大片段的鏈在DNA分子內遷移。

　　（二）修復方式：

　　1． 直接修復：又稱光修復，由光修復酶修復因紫外照射引起的嘧啶二聚體，使其還原。

　　2． 切除修復：見上。

　　3． 重組修復：當損傷的DNA尚未進行修復就已經(jīng)進行復制，復制出的子代DNA會出現(xiàn)缺口，此時所產(chǎn)生的子代DNA就需進行重組修復。重組蛋白RecA具有核酸酶活性，將健康母鏈中與缺口對應的一股DNA片段重組到子鏈缺口處，而健康母鏈出現(xiàn)的缺口，可按健康的模板由DNA聚合酶催化填補，然后由連接酶連接，最后將健康鏈完全復原。

　　4． SOS修復：是DNA損傷到難以繼續(xù)復制時，細胞采取的一種應急性修復方式。DNA損傷嚴重，誘導出一系列的復雜反應，產(chǎn)生SOS修復酶系，包括重組蛋白、調控蛋白以及復制、修復的酶系統(tǒng)等。

　　三、DNA的反轉錄合成

　　反轉錄又稱逆轉錄，指遺傳信息從RNA流向DNA。是RNA指導下的DNA合成過程，即以RNA為模板，四種dNTP為原料，合成與RNA互補的DNA單鏈，催化這一過程的酶稱反轉錄酶，RNA病毒中都含有此酶。

　　1． 反轉錄酶：屬RNA指導的DNA聚合酶，具有三種酶活性，即RNA指導的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指導的DNA聚合酶。在分子生物學技術中，作為重要的工具酶被廣泛用于建立基因文庫、獲得目的基因等工作。

　　2． 合成過程；RNA為模板，在反轉錄酶的催化下，合成與RNA互補的DNA單鏈，形成雜化雙鏈，反轉錄酶將其中RNA鏈水解，在以互補的DNA鏈為模板，合成雙鏈DNA。

　　3． 反轉錄方向：5’→3’。