【摘要】  目的研究涼燥對(duì)小鼠的主要致病機(jī)制。方法216只無(wú)特定病原體級(jí)（SPF）昆明小鼠隨機(jī)分為常溫常濕組（A組），常溫燥組（B組），涼燥組（C 組），每組72只。在模擬涼燥條件下造模，第7天與第14天檢測(cè)氣道與皮膚組織病理、氣管纖毛運(yùn)動(dòng)、氣道液分泌（RS）與氣道液IgG抗體（IgGR）、血液流變學(xué)、細(xì)菌攻擊實(shí)驗(yàn)與氣管細(xì)胞bcl-2基因、bax基因表達(dá)。結(jié)果與A組相比，C組第14天氣管、肺與皮膚病變明顯，肺細(xì)菌數(shù)增高，IgGR增高，第7天RS降低（P<0.01），血液流變學(xué)影響不明顯，但氣管細(xì)胞bcl-2基因表達(dá)下降。結(jié)論 涼燥傷肺、傷津，致氣道“纖毛-黏液毯”局部御邪屏障受損；肺津凝滯于肺，以致宣輸失司則皮膚失養(yǎng)。本結(jié)果為涼燥致病提供實(shí)驗(yàn)資料。

　　【關(guān)鍵詞】  涼燥 致病機(jī)制

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the pathogenic effects of Cool-Dry on mice.Methods216 Kunming mice（SPF） were divided into three groups including group A（normal mice）， group B（normal temperature and OuterDry mice），group C（Cool-Dry mice），72mice/group. Respiratory secretion of Mucopolysacchride（RS），IgG of Respiratory（IgGR），hemorrheology，Bacterial attacking and Expression of bcl2，bax gene were tested in day 7 and 14.ResultsIn group C the pathologreal changes of respiratory and skins were obvious， and bacillia quantity of lung increased，bcl2 gene expression was reduced significantly compared with group A（P<0.01） .ConclusionIt has first provided the evidences of CoolDry that injured the windpipe and skins and the defenced of “l(fā)anket of Cilla-mucus”and reduced the expression of bcl-2 gene， which was related to the mechanisms of CoolDry.

　　Key words：Cool-Dry；   Pathogenic mechanism

　　燥氣清冷肅降，肅殺收引，“燥氣先傷于華蓋”，易傷津液?！扒锷畛鯖?，西風(fēng)肅殺，感之者，多病風(fēng)燥，此屬燥涼，較嚴(yán)冬風(fēng)寒為輕?！蓖庠镉袦卦锱c涼燥之分，但未見(jiàn)涼燥病機(jī)系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。在相關(guān)研究中證實(shí)外燥致小鼠氣道病變的基礎(chǔ)上［1］，本文研究涼燥及相兼細(xì)菌攻擊對(duì)小鼠氣管纖毛運(yùn)動(dòng)、氣道液分泌與氣道液IgG抗體、血液流變學(xué)及氣管細(xì)胞bcl2基因，bax基因表達(dá)等影響，為闡析涼燥致病機(jī)制提供資料。

　　1  材料與方法

　　1.1  動(dòng)物

　　無(wú)特定病原體級(jí)（SPF）昆明種小鼠216只，體重（18±1）g，雌雄各半，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2003-2005.

　　1.2  儀器與試劑

　　LRH250人工智能氣候箱（溫度：（30～65±1）℃，相對(duì)濕度：（30～90）%±5%，廣東醫(yī)療器械廠(chǎng)），XSJD恒溫倒置顯微鏡（重慶顯微鏡廠(chǎng)），CS501超級(jí)恒溫器（重慶實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)），756MC紫外分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)ASCO全自動(dòng)血液流變儀（重慶南方醫(yī)療設(shè)備公司）。咔唑（批號(hào)：054K078，Sigma公司），D-葡萄糖醛酸內(nèi)酯（批號(hào)：2711EC，Sigma公司），四硼酸鈉與臺(tái)氏液試劑、10%甲醛、HE染料（分析純，批號(hào)：050108）上海精細(xì)化工科技有限公司。TUNEL試劑盒（MK1020，200503）、bcl2兔抗鼠IgG多抗（BA0412，200503）、bax兔抗鼠IgG多抗（BA0315，200503）和陽(yáng)性對(duì)照片由武漢博士德生物工程有限公司提供。

　　1.3  菌株

　　金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 25923，北京天壇生物制品公司）。

　　1.4  方法

　　1.4.1  動(dòng)物模型及分組

　　216只昆明小鼠隨機(jī)分為常溫常濕組、常溫燥組、涼燥組，每組72只，分批置人工氣候箱內(nèi)、用昆明種小鼠飼料常規(guī)飼養(yǎng)。按表1模擬外燥“溫度相對(duì)濕度風(fēng)”條件進(jìn)行造模。各組第7天和第14天進(jìn)行檢測(cè)前4 h禁食、禁水。表1  各組小鼠“溫度－相對(duì)濕度－風(fēng)”處理?xiàng)l件（略）

　　1.4.2  病理組織學(xué)觀(guān)察

　　斷頸處死小鼠，常規(guī)取氣管1.5cm，右肺組織（中）（40±10）mg/只、背部皮膚（0.5 cm × 0.5 cm）及左足墊皮膚，HE染色、鏡檢。

　　1.4.3   氣管上皮纖毛運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)（Cilia movement of Tracheal Epithelium，CM，min/mm）：按文獻(xiàn)方法［2］。

　　1.4.4  氣道液黏多糖（Respiratory secretion of Mucopolysacchride，RS，μg/ml）測(cè)定：咔唑比色法，參考文獻(xiàn)方法［2］。

　　1.4.5  氣道液IgG（IgG-R）檢測(cè)

　　常規(guī)氣管插管，取灌洗液分離上清，按酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。以包被液作空白對(duì)照，PBS pH 7.4（10%小牛血清）作陰性對(duì)照。每份樣品檢測(cè)3次，記錄標(biāo)本均值與陰性對(duì)照（P/N）倍數(shù)之平均值。

　　1.4.6  血液流變學(xué)檢測(cè)［3］

　　受血液流變儀對(duì)血量標(biāo)本的限制，每組取9只小鼠眼球血合為1份標(biāo)本進(jìn)行測(cè)試，3份/組。肝素抗凝管取眼球血，4 h內(nèi)測(cè)定血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞剛性指數(shù)。

　　1.4.7  細(xì)菌攻擊實(shí)驗(yàn)

　　取培養(yǎng)18 h金黃色葡萄球菌，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)比濁法配成細(xì)菌懸液（1×108 cfu/ml），各組小鼠于第7天經(jīng)鼻常規(guī)滴種金黃色葡萄球菌0.1 ml/只，24 h后重復(fù)1次。接種細(xì)菌第6天無(wú)菌取小鼠右肺（40±10）mg/只常規(guī)檢測(cè)肺細(xì)菌數(shù)（Bacillia Quantity，BQ，1×106 cfu/g取均值），以及RS與IgGR ［4］。

　　1.4.8  氣管細(xì)胞凋亡檢測(cè)

　　第14天取氣管切片，按脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）試劑盒程序操作。結(jié)果判斷：氣管上皮細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為T(mén)UNEL染色陽(yáng)性。鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算：

　　細(xì)胞凋亡率（%） = 凋亡細(xì)胞數(shù)200 ×100%

　　1.4.9  氣管細(xì)胞bcl-2基因，bax基因表達(dá)檢測(cè) 第14天常規(guī)取氣管標(biāo)本切片、按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。結(jié)果判斷：氣管上皮細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為bcl-2（或bax）表達(dá)陽(yáng)性。鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算：

　　陽(yáng)性指數(shù)（PI）=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)記數(shù)細(xì)胞數(shù)× 100%

　　1.4.10  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS13.0軟件，資料之間比較用ANOVA分析，顯著性檢驗(yàn)采用多個(gè)樣本均數(shù)間q檢驗(yàn)（Newman-Keuls法）；各組第7天與第14天比較用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05.

　　2  結(jié)果

　　2.1  氣管、肺結(jié)構(gòu)觀(guān)察常溫常濕組第7、第14天氣管上皮結(jié)構(gòu)完整、纖毛整齊，氣管腺體、細(xì)支氣管與肺泡未見(jiàn)異常，背部皮膚結(jié)構(gòu)完整，毛球數(shù)多，新生毛干數(shù)豐富且層次清晰，足墊皮膚汗腺豐富。常溫燥組第14天部分氣管纖毛倒伏、黏連，肺泡輕度淤血，皮膚未見(jiàn)異常；涼燥組第14天氣管上皮鱗狀化生，氣管纖毛多呈灶狀缺損，≤20%氣管漿液腺上皮黏液腺化生，肺部淤血、水腫明顯，均較第7天嚴(yán)重；背部皮膚無(wú)明顯異常，但足墊部皮膚腺體明顯減少與皮下結(jié)締組織增生。

　　2.2  涼燥對(duì)氣管上皮纖毛運(yùn)動(dòng)（CM）、氣道液黏多糖（RS）與IgGR的影響結(jié)果見(jiàn)表2.表2  涼燥對(duì)小鼠氣管纖毛運(yùn)動(dòng)、氣道液黏多糖與IgG-R的影響（略）

　　2.3  涼燥對(duì)小鼠血液流變學(xué)的影響見(jiàn)表3.與常溫常濕組比較，涼燥組血液流變學(xué)指標(biāo)改變無(wú)顯著性。表3  涼燥對(duì)小鼠血液黏度的影響（略）

　　2.4   涼燥相兼細(xì)菌攻擊對(duì)小鼠肺細(xì)菌數(shù)（BQ）、呼吸道液黏多糖（RS）與IgG-R的影響見(jiàn)表4.表4  細(xì)菌攻擊對(duì)涼燥小鼠BQ、RS與IgG-R的影響（略）

　　2.5  涼燥對(duì)氣管細(xì)胞凋亡與bcl-2基因、bax基因表達(dá)的影響見(jiàn)表5.表5  涼燥對(duì)小鼠氣管上皮細(xì)胞bcl-2、bax基因表達(dá)與細(xì)胞凋亡的影響（略）

　　3  討論

　　按表1條件處理，病理檢查可見(jiàn)涼燥組第14天氣管上皮鱗狀化生與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管纖毛多呈灶狀缺損，肺泡充血、水腫明顯，表明涼燥傷肺、傷津，肺失其濡養(yǎng)而致組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損；≤20%氣管漿液腺上皮黏液腺化生，提示與涼燥肺津生成障礙相關(guān)；足墊皮膚汗腺明顯減少與結(jié)締組織增生等，表明肺宣輸失司、皮毛腠理失之濡潤(rùn)，合以衛(wèi)表不固，致“燥氣先傷于華蓋”。本結(jié)果為涼燥致病提供組織學(xué)證據(jù)。

　　氣道液內(nèi)含黏蛋白（主為黏多糖和蛋白質(zhì)），覆蓋于黏膜表面形成黏液毯，是氣道的重要保護(hù)性屏障之一；RS與氣道液分泌呈正相關(guān)，其主要作用是濕潤(rùn)氣道黏膜、保護(hù)上皮的纖毛運(yùn)動(dòng)。與常溫常濕組比較，涼燥組第7天RS減少，顯示涼燥早期氣道液分泌嚴(yán)重減少而具“干”之特點(diǎn)。值得注意的是涼燥組第14天 RS明顯增多（P<0.01），其機(jī)理可能是涼燥之邪的涼氣可傷肺陽(yáng)而致肺津不化、凝聚成痰飲，故氣道液明顯增加。氣道纖毛受“涼凝”之氣道液刺激而病理性運(yùn)動(dòng)加快。涼燥組細(xì)菌攻擊后RS明顯減少，也提示生物病原攻擊可加重氣道分泌障礙與“正氣”受損［5］。IgG-R是氣道重要免疫防御成分之一，涼燥組第7～14天以及細(xì)菌攻擊后RS增高，與機(jī)體的保護(hù)性反應(yīng)有關(guān)。涼燥相兼細(xì)菌攻擊，外則衛(wèi)滯邪郁，內(nèi)則津少氣虛，抗邪無(wú)力則病邪入里；肺津不化則凝成痰飲，細(xì)菌及其毒素可加重肺津生成障礙與宣輸失司更甚，加之氣道局部御邪屏障受損則對(duì)生物病原攻擊的敏感性增高，但故涼燥組肺細(xì)菌數(shù)是常溫常濕組的7.1倍，結(jié)果提示涼燥病機(jī)之一與損傷氣道分泌與“纖毛-黏液毯”有關(guān)。涼燥組血液黏度變化不明顯，但紅細(xì)胞剛性指數(shù)增高，提示血液運(yùn)行障礙，其機(jī)理有待研究。

　　bcl-2屬于低豐度表達(dá)基因，編碼的bcl-2/bax 家族蛋白如bcl-2/bax二聚體為抑制細(xì)胞凋亡構(gòu)型，bax/bax二聚體可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，常溫常濕組與涼燥組氣管細(xì)胞凋亡率均較低（≤0.3%），但涼燥組氣管bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞多見(jiàn)于氣管纖毛缺損或鱗狀上皮化生處，提示與涼燥致病機(jī)制相關(guān)。

　　結(jié)果表明，涼燥主要病機(jī)可能是：涼燥傷津，涼燥之邪的涼氣可傷肺陽(yáng)而致肺津不化，凝集成痰飲，合以宣輸失司，皮毛腠理失養(yǎng)而致衛(wèi)表不固；肺津生成銳減，氣道“纖毛-黏液毯”生物防御屏障受損，合以對(duì)生物病原攻擊敏感性增加等綜合因素致病。涼燥致氣管細(xì)胞bcl-2基因表達(dá)下調(diào)與涼燥致病機(jī)制的相關(guān)性值得研究。

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