高效液相色譜（HPLC：High Performance Liquid Chromatography ）是化學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、商檢、藥檢、法檢等學(xué)科領(lǐng)域與專業(yè)最為重要的分離分析技術(shù)，是分析化學(xué)家、生物化學(xué)家等用以解決他們面臨的各種實際分離分析課題必不可缺少的工具。國際市場調(diào)查表明，高效液相色譜儀在分析儀器銷售市場中占有最大的份額，增長速度最快。高效液相色譜的優(yōu)點是：檢測的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復(fù)性好，定量精度高，應(yīng)用范圍廣。適用于分析高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差的化合物。其缺點是：價格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析生物大分子和無機離子困難，流動相消耗大且有毒性的居多。目前的發(fā)展趨勢是向生物化學(xué)和藥物分析及制備型傾斜。 1 基本原理

　　固定相 —— 柱內(nèi)填料，流動相 —— 洗脫劑。

　　HPLC是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動相之間分配系數(shù)的不同，進行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達到分離的過程。

　　通常，按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)可以作如下的分類：分配色譜：—— 分配系數(shù)

　　親和色譜：—— 親和力

　　吸附色譜：—— 吸附力

　　離子交換色譜：—— 離子交換能力

　　凝膠色譜（體積排阻色譜）：—— 分子大小而引起的體積排阻

　　分配色譜又可分為：

　　正相色譜：固定相為極性，流動相為非極性。

　　反相色譜：固定相為非極性，流動相為極性。用的最多，約占60～70％。

　　固定相（柱填料）：

　　固定相又分為兩類，一類是使用最多的微粒硅膠，另一類是使用較少的高分子微球。后者的優(yōu)點是強度大、化學(xué)惰性，使用pH范圍大，pH=1～14，缺點是柱效較小，常用于離子交換色譜和凝膠色譜。

　　最常使用的全孔微粒硅膠（3～10μm）是化學(xué)鍵合相硅膠，這種固定相要占所有柱填料的80％。它是通過化學(xué)反應(yīng)把某種適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)官能團（例如各種有機硅烷），鍵合到硅膠表面上，取代了羥基（－OH）而成。它是近代高效液相色譜技術(shù)中最重要的柱填料類型。使用微粒硅膠要特別注意它的使用pH范圍是 2～7.5，若過堿（＞pH7.5），硅膠會粉碎或溶解；若過酸（＜pH2＝，鍵合相的化學(xué)鍵會斷裂。 鍵合相使用硅膠作基質(zhì)的優(yōu)點是：①硅膠的強度大；②微粒硅膠的了孔結(jié)構(gòu)和表面積易人為控制。③化學(xué)穩(wěn)定性好。 硅膠 （ SiO2 nH2O） ：

　　重要的鍵合相是：硅烷化鍵合相，它是硅膠與有機硅烷反應(yīng)的產(chǎn)物。

　　最常用的鍵合相鍵型是：

　　X ━ Cl，CH3O，C2H5O等。 R ━ 烷：C8H17（即C8填料），C10H21，C18H37等。 R1 、R2 ━ X、CH3等。 最常用的"萬能柱"填料為"C18"，簡稱"ODS"柱，即十八烷基硅烷鍵合硅膠填料（Octadecylsilyl，簡稱ODS）。這種填料在反相色譜中發(fā)揮著極為重要的作用，它可完成高效液相色譜70～80％的分析任務(wù)。由于C18（ODS）是長鏈烷基鍵合相，有較高的碳含量和更好的疏水性，對各種類型的生物大分子有更強的適應(yīng)能力，因此在生物化學(xué)分析工作中應(yīng)用的最為廣泛，近年來，為適應(yīng)氨基酸、小肽等生物分子的分析任務(wù)，又發(fā)展了CH、C3、C4等短鏈烷基鍵合相和大孔硅膠（20～40μm）。 按鍵合到基質(zhì)上的官能團可分為： ⑴反相柱：填料是非極性的，官能團為烷烴，例如：C18（ODS）、C8、C4等。 ⑵正相柱：填料是極性的，官能團為－CN氰基、－NH2氨基等。 ⑶離子交換鍵合相： 陽離子官能團：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。 陰離子官能團：―R4N＋季銨基、-氨基等。 （ 由于硅膠基質(zhì)的鍵合相只能在pH＝2～7.5的范圍內(nèi)使用，而離子交換色譜要求有更寬的pH范圍，因此其基質(zhì)現(xiàn)在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。） 流動相： 反相色譜最常用的流動相及其沖洗強度如下： H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜異丙醇＜四氫呋喃 最常用的流動相組成是："甲醇-H2O"和"乙腈-H2O"，由于乙腈的劇毒性，通常優(yōu)先考慮"甲醇-H2O"流動相。 反相色譜中，溶質(zhì)按其疏水性大小進行分離，極性越大疏水性越小的溶質(zhì)，越不易與非極性的固定相結(jié)合，所以先被洗脫下來。流動相的pH對樣品溶質(zhì)的電離狀態(tài)影響很大，進而影響其疏水性，所以在分離肽類和蛋白質(zhì)等生物大分子的過程中，經(jīng)常要加入修飾性的離子對物質(zhì)，最常用的離子對試劑是三氟乙酸（TFA），使用濃度為0.1％，使流動相的pH值為2～3，這樣可以有效地抑制氨基酸上α羧基的離介，使其疏水性增加，延長洗脫時間，提高分辨率和分離效果。 完全離子化的溶質(zhì)，例如強酸或強堿，其在反相鍵合相上的保留值很低，近于死時間流出，不能進行分析。根據(jù)離子對色譜的原理將一種與樣品離子電荷（A＋）相反的離子（B－），稱為對離子，加入到流動相中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對，即中性締合物，從而增強了樣品的疏水性，加大了保留值，改善了分離效果。 正相色譜常用的流動相及其沖洗強度的順序是： 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜異丙醇 其中最常用的是正已烷，雖然其價格較貴，但80％的順、反和鄰位、對位異構(gòu)體仍然要用正相色譜來進行分離。流動相的選擇原則是：①樣品易溶，且溶解度盡可能大。②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱子。③不妨礙檢測器檢測，紫外波長處無吸收。④粘度低，流動性好。⑤易于從其中回收樣品。⑥無毒或低毒，易于操作。⑦易于制成高純度，即色譜純。⑧廢液易處理，不污染環(huán)境。

　　2 基本參數(shù) 2.1. 保留值

　?、疟Ａ魰r間"tR"：進樣至出峰的時間。⑵死時間"t0"：不被柱子吸附的惰性物質(zhì)的出峰時間。死時間"t0"的測定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物質(zhì)，例如：正相色譜常用四氯化碳，反相色譜常用甲醇、尿嘧啶、NaNO2、NaNO3等。⑶容量因子"k‘"： 或： "k’"是比"tR"還常用的保留值，它與柱子的大小及流速無關(guān)，只與溶質(zhì)在固定相和流動相的分配性質(zhì)、柱溫以及相空間比（即固定相和流動相之體企積比）有關(guān)。"k‘"又定義為在分配平衡時某溶質(zhì)在兩相中絕對量之比，消除了保留值的波動因素，而平衡常數(shù)"K"是平衡時物質(zhì)在兩相中的濃度比。 k’值的范圍： 0.4＜k‘＜20～30 k’＝2～5為佳， 過大則耗時太長。⑷保留體積：VR＝tR FC （ FC —— 流動相的流速 ml/min ） VR是在tR時間內(nèi)流動相流過柱子的體積。 調(diào)整保留時間：tR‘＝ tR－t0 調(diào)整保留體積：VR’＝ VR－VR0＝tR‘ FC⑸選擇性指標(biāo)"α’"和相對保留值"α" α‘可以更直觀和方便地反映色譜峰分離的好壞：

　　相對保留值（分離因子）：

　　（ α＞1.1為好 ）2.2 柱效率：

　　定義： 理論塔板數(shù) （ 每米柱 ）

　　s——標(biāo)準(zhǔn)偏差，曲線拐點處峰寬的一半，即峰高0.607處峰寬的一半

　　為便于測量，改用半峰寬：W1/2（ 或2×△t1/2 ）

　　最常用的計算式： 另一計算式： Wb不如W1/2容易測量，因而此式用的較少。

　　理論塔板高度：H=L/N L—— 柱長

　　經(jīng)驗式：H＝2dP （ dP＝10μ H＝20μ N＝5萬 ）

　?。?dP＝5μ H＝10μ N＝10萬 ）

　　dP 柱填料的顆粒直徑

　　柱效的測定和計算：

　　以反相柱為例，流動相用87％（V/V）的甲醇：水，樣品用苯、聯(lián)苯、萘等，加快記錄儀的走紙速度，測出半峰寬W1/2，并由走紙速度換算為與tR相同的單位"分"或"秒"，代入公式，計算出柱效N.提高柱效的方法：①固定相填料要均一，顆粒細(xì)，裝填均勻。②流動相粘度低。③低流速。④升高柱溫。2.3. 不對稱因子"Tf"： 用于形容色譜峰拖尾和前伸的程度，多數(shù)為拖尾峰。

　　A、B如上圖所示

　　通常 Tf＝1.2～1.3 ，若 Tf＞2 則峰不合格。

　　峰拖尾的原因是硅膠基質(zhì)上的Si－OH羥基未被全部鍵合而與溶質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。

　　改進拖尾要用封尾技術(shù)：即用小分子的含甲基的物質(zhì)再次對硅膠進行鍵合，封閉硅羥基；還可在流動相中加入帶 -NH2氨基（對羥基敏感）的物質(zhì)，將殘余的羥基掩閉。

　　分辨率：

　　2.4. 分離度 K1和 K3HPLC的目的和要求是：峰要盡可能窄（W1/2小），峰的間距盡可能大（tR相差大）。

　?、呕€分離度 K1 ： 基線分離時用K1.

　?、品甯叻蛛x度：

　　K3＝1 基線分離，K3 更反映了實際分離心度。

　　2.5. 線速度：溶劑在柱中移動的速度。

　　L─柱長 t0 ─死時間 H（μm）

　　如右圖所示，用實驗可找到最佳的線速度： 即圖中的A點：u＝1 mm/sec

　　此處不用流量而用線速度，是因為流量與 柱徑有關(guān)，而線速度與柱徑無關(guān)。 請記住不同柱內(nèi)徑的最佳流量： A u（1mm/sec）

　　柱內(nèi)徑 流量 線速度5 mm 1.0 mL/min 1 mm/sec2 mm 0.2 mL/min 1 mm/sec1 mm 50 μL/min 1 mm/sec

　　由1 mm/sec 最佳線速度可計算出適合各種柱徑的最佳流量。由上表可以看出，用5mm柱，一天要用一并昂貴的乙腈，若用1mm柱，則一個月才用一并。

　　2.6 保留值方程：

　　正相色譜： lnk‘＝a＋blnCb＋cCb Cb─強沖洗劑濃度反相色譜： lnk’＝a＋cCb 對于不同溶質(zhì) a、b、c 系數(shù)不同離子交換色譜： lnk‘＝a＋blnCb 反相色譜是線性方程

　　所以，改變Cb濃度，保留值k‘和選擇性α都改變了，尋找最佳的Cb濃度就是HPLC高效液相色譜技術(shù)的精髓所在。

　　例如，通常用10％～90％的甲醇/水，梯度洗脫30min，即可找出適宜的Cb濃度。

　　用高濃度Cb洗脫，可保證先將所有的峰都洗脫出來，不丟失組份，然后再調(diào)節(jié)Cb濃度，找到更好的分離效果，加大各組份色譜峰的分離度。甲醇降低10％，k‘可降低2～3倍。

　　7. 反相色譜的一般規(guī)律：

　　3 HPLC系統(tǒng)構(gòu)成

　　3.1 HPLC系統(tǒng)使用記錄1. 儀器使用記錄：⑴ 各組件的牌號、型號、編號、購進日期、安裝日期、保單。⑵ 標(biāo)準(zhǔn)參考條件的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（流動相、流速、壓力、溫度、檢測器參數(shù)、樣品量等）：反相色譜： 流動相：甲醇/水（70：30 V/V）柱：C18流速：1.0 mL/min檢測器：UV 254nm樣品：尿嘧啶（測t0）、苯酚、苯乙酮、硝基苯、苯甲醚、甲苯。⑶ 使用記錄：日期、工作內(nèi)容、開機時間、樣品數(shù)、儀器狀態(tài)、操作者。⑷ 維修記錄：日期、原因、修理人、結(jié)果。（可備專用維修記錄本）。⑸ 換柱：牌號、種類、尺寸、標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。⑹ 換部件：日期、原因、型號、編號、標(biāo)準(zhǔn)色譜圖、操作人。2. 個人實驗記錄⑴ 日期、天氣、室溫。⑵ 實驗?zāi)康?。?色譜系統(tǒng)：廠名、型號等。⑷ 操作條件：流動相（配比、pH、過濾脫氣情況）。⑸ 樣品：予處理方法、進樣體積。⑹ 分析結(jié)果：數(shù)據(jù)、資料、色譜圖。⑺ 現(xiàn)象記錄。⑻ 參考文獻。3. 色譜柱記錄⑴ 原始記錄：啟用日期、填料種類、牌號、編號、標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（流動相、流速、壓力、N、t0、tR、RS、Tf）。⑵ 使用記錄：儀器、樣品、操作人。⑶ 貯存記錄：潤濕溶劑、加蓋否。⑷ 維修記錄：日期、原因、措施（補柱頭、反沖、換板）。⑸ 柱壽命：N、色譜圖、操作人。

　　3.2 貯液器和流動相脫氣1.貯液器：常用干凈的無水甲醇試劑并作貯液器，并要加蓋以防灰塵落入，但并蓋與導(dǎo)管之間應(yīng)有縫隙，若過緊會形成真空。貯液并內(nèi)要放置燒結(jié)不銹鋼過濾器，即沉子，孔徑為10μm，其作用是：①防止灰塵進入泵缸。② 作為進液導(dǎo)管的重物，使導(dǎo)管能沉在并底。2.脫氣：正相色譜如非水性凝膠色譜的流動相不必脫氣，反相色譜的流動相需要脫氣。⑴ He氦氣脫氣：10min可以除去80～90％溶入的氣體，但價格昂貴。⑵ 真空脫氣：這是最常用的方法，可用真空抽濾流動相的方法代替。⑶ 超聲脫氣：使用方便，但只能脫氣30％。⑷ 加熱回流：最徹底的脫氣方法，混合流動相不能用。3. 注意：⑴ 溶劑過濾：常用0.5μm膜過濾。HPLC級溶劑：無微粒，無紫外吸收，已用0.2μm膜過濾。⑵ 貯液并要不定期更換，要有2～3個備用并，定期用酸、水、溶劑清洗。⑶ 沉子：用三個月后必須清洗或更換，若未用沉子，則必須用0.5μm膜過濾。⑷ 使用混合流動相時：易產(chǎn)生氣體，可在系統(tǒng)外予混合后脫氣。⑸ 流動相不暢的原因：管路阻塞、長了霉菌、管道空化、貯液并蓋子太緊。解決的辦法有：抬高貯液并或向并內(nèi)加壓；去掉沉子；用稀硝酸洗去管道內(nèi)微生物（洗前必須洗凈醇類）。

　　3.3 色譜柱填料： 國產(chǎn)：天津試劑工廠：YWG─C18H37進口：Zorbax─ODS常用柱尺寸：長25cm，內(nèi)徑4.6mm注意事項：1. 加流路過濾器與保護柱（予柱）：通常用3cm短柱，內(nèi)徑2mm.2. 避免高壓沖擊：進樣伐快轉(zhuǎn)；泵起動時要由小流量開始。3. 分離條件的選擇：pH：硅膠基質(zhì)：pH 2.5～7.0，聚合物填料：pH 1～13 .極端pH的流動相能溶解硅膠。溫度：高溫下用小顆粒填料柱會引起塌陷，柱效N下降一半：3μm柱，＞40℃；5μm柱，＞70℃。4. 柱的保存：通常灌注純有機溶劑保存。若用水（如凝膠柱），則加10％疊氮化鈉。5. 凈化樣品：①不含微粒；②防止蛋白質(zhì)沉淀在柱頭；③防止組分在固定相上保留過強。措施：先過濾樣品；先做予試驗（樣品加入流動相中變渾否？）；用予柱除去強保留組分。若用6M NaOH 溶解的樣品進樣50～10μL，硅膠柱就報廢。6. 定期洗柱：甲醇、乙腈洗掉柱中強保留組分，正向或反向洗，不要流過檢測器，若無效：則換不銹鋼過濾片，并用同種填料加乙醇調(diào)成糊狀，補平柱頭，或挖去2～3mm臟填料，重新填平（填料也可以不同種）。7. 延長柱壽命：修補柱頭；換不銹鋼過濾片；沖洗柱；倒向用（柱效要下降40～60％）。

　　3.4 泵─往復(fù)式恒流柱塞泵三大問題：1. 單向伐故障：紅寶石球與伐座密封不嚴(yán)。原因：⑴ 污染：氣泡、微粒。 解決方法：用25mL 水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷 依次沖洗。在稀硝酸中超聲15min ，用HPLC水洗2～3次、甲醇洗2次。⑵ 磨損：對調(diào)紅寶石球，使面密封變?yōu)榫€密封。2. 密封圈故障：滲漏、墊圈碎片污染系統(tǒng)。表現(xiàn)：壓力不穩(wěn)、泵頭漏液。通常三個月或不定期換密封圈。拆泵頭：蘭寶石桿要縮至最短。3. 氣泡：用脫氣后甲醇沖洗。予防措施：1. 用高質(zhì)量溶劑和水作流動相。2. 流動相脫氣。3.每天結(jié)束時：先用水洗，再用甲醇洗。若用過緩沖液：必須先水洗30～60min（1ml/ min），再甲醇洗30min，千萬不可先用甲醇沖洗，否則無機鹽沉淀堵了管路。 4. 及時換密封圈，加油。5. 用10mL水、10mL甲醇洗泵頭排水孔。6. 防止柱塞桿磨損。換新圈仍漏，則是柱塞桿被鹽劃傷。7.3.5 進樣器分手動、自動兩種，通常實驗室用的是手動。六通進樣伐：惰性聚合物轉(zhuǎn)子與陶瓷定子之間構(gòu)成密封面。內(nèi)裝式：針頭插到伐體內(nèi)的轉(zhuǎn)子部位，平頭，有直徑0.5mm和0.7mm兩種。完全裝液法與部分裝液法均可使用。外裝式：進樣孔與伐有距離，部分樣品留在進樣管道，不被注入樣品環(huán)管，因而最好使用完全裝液法注意：1. 內(nèi)裝式平針頭決不可過長，不可超出轉(zhuǎn)子面，否則將損壞進樣伐。進樣后可不拔出針頭，進樣量不限。外裝式進樣量要過量，進柱樣品量精確度比內(nèi)裝式高。 2. 轉(zhuǎn)手柄要快：＜1秒，不允許仃在中間！3. 用后要立即清洗：使用了強腐蝕性溶劑：用水和有機溶劑清洗。使用了含鹽緩沖液：用后立即用水洗凈進樣孔和導(dǎo)管，否則會損壞密封面。4. 針頭不可過細(xì)，否則針頭密封圈失效而滲漏。

　　3.6 檢測器檢測器的作用是將濃度的變化變成電信號。1. 紫外檢測器：195～350nm 的可變波長檢測器通常使用氘燈。1024個二極管的二極管陣列檢測器可作吸光度、時間和波長的三維檢測，畫出三維立體山峰形狀的圖形。 石英流動池為"Z"形，約8μl，光池為1mm×10mm.注意問題：⑴ 氘燈壽命只有 400～1000小時，要注意節(jié)燈。⑵ 氣泡：譜圖上出現(xiàn)許多毛刺峰，是光池內(nèi)有氣泡，可用脫氣后的甲醇或異丙醇沖洗。⑶ 污染與堵塞：反向沖洗順序為：50ml無水乙醇→50ml水→250ml 3M硫酸→100ml水。為防止酸噴出，可用反向負(fù)壓回抽法（用注射器）。⑷ 正確選擇檢測波長：通常用該樣品紫外掃描吸收光譜的波峰波長。2. 熒光檢測器：將溶質(zhì)樣品衍生為熒光物質(zhì)，檢測靈敏度比紫外高10～1000倍。3. 示差折光檢測器：靈敏度較低，用于糖類樣品的檢測。