【關(guān)鍵詞】  腦缺血；再灌注；絲裂原激活蛋白激酶類；細(xì)胞凋亡；梗塞，大腦中動(dòng)脈；大鼠

　　Expression of extracellular signalregulated kinase in focal cerebral ischemia

　　ZHANG XiaoYan， YANG JinSheng， GU YouQuan， SHI XiangQun

　　Department of Neurology， Lanzhou General Hospital， Lanzhou Uilitary Area Command， Lanzhou 730050， China， Clinical Medical School， Lanzhou Mniversity， Lanzhou 730000， China

　　【Abstract】  AIM： To study the role of extracellular signalregulated kinase （ERK） during focal cerebral ischemiareperfusion in hippocampal neurons of rats. METHODS： Sixty male adult Wistar rats were randomly divided into 2 groups （n=30 per group）： the sham operation group and the ischemiareperfusion group（I/R group）。 The rats of I/R group were subjected to 2 h of right middle cerebral artery occlusion （MCAO） with introducing a nylon suture to the right internal carotid artery and then 3， 6， 24， 48 and 72 h of reperfusion， respectively（as 5 subgroups， n=6 in each subgroup）。 The histopathologic changes were observed by HE staining. The apoptotic neurons were detected in CA1 area of hippocampus by TUNEL method. ERK phosphorylation was detected by immunohistochemistry. RESULTS： In I/R group as compared with shamoperation group， after MCAO， the survival neurons in CA1 areas decreased； a lot of apoptotic cells were observed and peaked at 48 h； ERK activity increased 3 h after MCAO and peaked at 6 h and returned to the normal level at 72 h. CONCLUSION： Cerebral ischemiareperfusion may result in the upregulation of ERK activity， and participate in the process of neuron apoptosis.

　　【Keywords 】 brain ischemia； reperfusion； mitogen activated protein kinases； apoptosis； infarction， middle cerebral artery； rats

　　【摘要】 目的： 研究細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）在局灶性腦缺血再灌注海馬神經(jīng)元中的表達(dá)。 方法：線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型。 大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（sham組）、腦缺血再灌注組（I/R組），每組根據(jù)再灌注時(shí)間不同再分為3，  6，  24，  48和72 h亞組，每亞組各6只鼠。 在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行HE染色觀察組織學(xué)變化；TUNEL法檢測(cè)CA1區(qū)細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律；免疫組織化學(xué)方法研究ERK的表達(dá)特征。 結(jié)果：MCAO后海馬神經(jīng)元存活數(shù)量較假手術(shù)組明顯減少；凋亡細(xì)胞大量出現(xiàn)，以48 h為高峰；MCAO后3 h，磷酸化ERK在局灶性腦缺血大鼠腦組織中顯著升高，6 h達(dá)到最高峰，72 h恢復(fù)到正常水平。 結(jié)論： 腦缺血再灌注損傷可能導(dǎo)致ERK活性上調(diào)，參與缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程。

　　【關(guān)鍵詞】 腦缺血；再灌注；絲裂原激活蛋白激酶類；細(xì)胞凋亡；梗塞，大腦中動(dòng)脈；大鼠

　　0引言

　　近年來(lái)人們對(duì)腦缺血再灌注損傷進(jìn)行了廣泛研究，認(rèn)為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activation protein kinases， MAPKs）通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子而改變基因的表達(dá)水平，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及凋亡等生理、病理過程。 MAPKs的3個(gè)亞組： ERK， P38和cJun氨基末端激酶（cJunNH2terminal kinase， JNK）。 他們可被許多因子激活，并通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性而控制基因表達(dá)［1］。 研究發(fā)現(xiàn)ERK， p38和JNK在心、腦、肝、腎等組織細(xì)胞的缺血/再灌注過程中可被激活［2-3］。 我們選用大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，測(cè)定在再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)，缺血腦海馬CA1區(qū)ERK的活性特征及細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，試圖闡明ERK在大鼠腦缺血再灌注過程中所起的作用和機(jī)制。

　　1材料和方法

　　1.1材料凋亡檢測(cè)試劑盒、ERK試劑盒、DAB顯色劑均購(gòu)于武漢博士德公司。 健康雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，由蘭州大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

　　1.2方法

　　1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組大鼠于術(shù)前在22～25℃環(huán)境中飼養(yǎng)1～2 d，術(shù)前夜禁食，隨意進(jìn)水。 隨機(jī)分成假手術(shù)組（sham組）、缺血再灌注組（I/R組），根據(jù)再灌注時(shí)間不同每組再分為3， 6， 24， 48和72 h， 5個(gè)亞組，每亞組各6只鼠。

　　1.2.2模型制作根據(jù)Nagasawa等［4］的改良線栓法制成大鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型。 用水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，將其仰臥固定，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）及頸外動(dòng)脈（ECA），結(jié)扎ECA與CCA，用動(dòng)脈夾夾閉ICA遠(yuǎn)心端后，迅速于ECA 與ICA分叉下方剪一切口，將一預(yù)先用酒精燈燒成圓頭的尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入深度為（18.5±0.5） mm，直到有輕微阻力感為止，實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致腦缺血。 結(jié)扎入口處，尼龍線外留約1 cm，縫合皮膚。 2 h后輕輕提拉所留線頭至略有阻力，實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈再灌注，造模完成。 在缺血2 h和再灌注1 h內(nèi)，用白熾燈加熱維持大鼠的體溫，體溫維持在肛溫36.5～37.5℃。 假手術(shù)組只分離CCA與ECA.動(dòng)物模型建立成功后按Longa等［5］法對(duì)動(dòng)物的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，均在2～3分，即以動(dòng)物清醒后，爬行時(shí)向左轉(zhuǎn)圈（追尾現(xiàn)象），提尾時(shí)左前肢內(nèi)收屈曲。 未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)者視為模型制作失敗，不計(jì)入實(shí)驗(yàn)組。 因麻醉未清醒和經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)存在有蛛網(wǎng)膜下腔出血者均視為模型制作失敗，不計(jì)入實(shí)驗(yàn)組。

　　1.2.3組織切片的制備大鼠再灌注后于3， 6， 24， 48和72 h各時(shí)間點(diǎn)，用水合氯醛深度麻醉動(dòng)物后開胸暴露心臟，經(jīng)升主動(dòng)脈插管剪開左心耳，用生理鹽水250 mL快速?zèng)_洗，隨后用多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（4℃， pH 7.4）先快后慢灌注約250 mL固定，斷頭取腦后， 在多聚甲醛中固定6～8 h，取視交叉后1～4 mm腦塊進(jìn)行石蠟包埋，冠狀面切片，取齒狀回與海馬互包平面的切片，片厚3 μm.

　　1.2.4HE染色、組織學(xué)觀察3 μm切片貼片，空氣中干燥，入二甲苯脫脂，乙醇梯度脫水，蘇木素伊紅（HE）染色，二甲苯透明，中性樹脫封片，取24， 48， 72 h組大鼠切片在400倍光鏡下計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)中段100單位長(zhǎng)度內(nèi)存活神經(jīng)元數(shù)目。

　　1.2.5免疫組織化學(xué)采用免疫組化SABC法進(jìn)行染色。 切片上滴加1∶200兔抗ERK抗體，4℃孵育過夜，接著用生物素連接的羊抗兔二抗在室溫下反應(yīng)90 min，再用卵白素生物素復(fù)合物室溫下反應(yīng)90 min，最后用DAB溶液顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。 貼片，空氣中干燥，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，在顯微鏡下計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)中段100單位長(zhǎng)度內(nèi)ERK染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

　　1.2.6原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)取海馬冠狀石蠟切片，常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水。 蛋白酶K（20 mg/L）室溫消化，用甲醇配制的過氧化氫消除內(nèi)源性辣根過氧化物酶活性，加末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）與地高辛標(biāo)記的dUTP混合反應(yīng)液進(jìn)行孵育，再加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體孵育，用DAB顯色，核呈深棕黃色者為凋亡細(xì)胞，最后脫水透明封片。 在40×10倍Olympus顯微鏡下攝像觀察各組間細(xì)胞凋亡變化趨勢(shì)。 在400倍光鏡下計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)中段100單位長(zhǎng)度內(nèi)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 所有數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，兩組資料不同的時(shí)間測(cè)量值比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α＝0.05.

　　2結(jié)果

　　2.1HE染色、海馬CA1區(qū)組織學(xué)改變假手術(shù)組中可見大鼠神經(jīng)元數(shù)量多，排列整齊，形態(tài)完整；缺血組有神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，分布不均，細(xì)胞周圍間隙增寬，有的細(xì)胞體積縮小，核固縮深染（圖1）。 sham組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)存活神經(jīng)元數(shù)目無(wú)變化。 I/R組大鼠CA1區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)在I/R后48和72 h顯著少于I/R后24 h（P<0.05）。 與sham組相比較，大鼠I/R后各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)目均明顯減少（表 1）。

　　A： 假手術(shù)組；B：缺血再灌注組。

　　圖1海馬CA1區(qū)神經(jīng)元改變HE ×400（略）

　　表1大鼠腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)存留神經(jīng)元數(shù)目（略）

　　aP<0.05 vs假手術(shù)；cP<0.05 vs缺血再灌注24 h.

　　2.2免疫組織化學(xué)染色及定量分析ERK染色陽(yáng)性呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀，在細(xì)胞核內(nèi)及胞漿內(nèi)均有表達(dá)。 ERK活性表達(dá)于再灌注后3 h明顯增加，陽(yáng)性細(xì)胞胞體較大，并有樹枝狀突起，主要分布于缺血皮層細(xì)胞層及皮層下區(qū)域，如海馬分子層、基底節(jié)外層及缺血側(cè)胼胝體。 ERK活性于再灌注后6 h達(dá)到高峰（圖2），72 h恢復(fù)到正常水平。 除72 h I/R組ERK活性表達(dá)與sham組比較無(wú)顯著差異外（P>0.05），其余I/R組ERK活性表達(dá)較sham組均有明顯增加（P<0.01）（表 2）。

　　A： 假手術(shù)組；B：缺血再灌注組。

　　圖26 h組免疫組織化學(xué)染色海馬CA1區(qū)神經(jīng)元SABC ×400（略）

　　表2大鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)ERK表達(dá)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目（略）

　　P＜0.01 vs假手術(shù)。

　　2.3TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)，假手術(shù)組基本上未見到染色陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞。 缺血再灌注組3 h開始即出現(xiàn)染為黃色的凋亡細(xì)胞，隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞增多，并有細(xì)胞核固縮、凋亡小體等凋亡中晚期形態(tài)特征出現(xiàn)。 凋亡細(xì)胞數(shù)于48 h達(dá)到高峰（圖3），72 h以后凋亡細(xì)胞逐漸減少。 缺血再灌注組與對(duì)應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較調(diào)亡神經(jīng)元數(shù)目有顯著性差異（P<0.01，表3）。

　　A：假手術(shù)組；B：缺血再灌注組。

　　圖348 h組海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元TUNEL ×400（略）

　　表3大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)目（略）

　　P<0.01 vs假手術(shù)。

　　3討論

　　ERK傳導(dǎo)通路在局灶性腦缺血中發(fā)揮重要作用。 Wu等［2］報(bào)道，小鼠MCAO后30 min到2 h ERK水平（用western blotting檢測(cè)）在壞死組織中達(dá)高峰，在6 h后仍能檢測(cè)到。  沙土鼠全腦缺血35 min后再灌注10 min，在CA1區(qū)檢測(cè)到ERK增加，但在1 h減少，同時(shí)在DG區(qū)可檢測(cè)到ERK活性增加［6］。 因此缺血再灌注時(shí)ERK活性的增加是細(xì)胞針對(duì)缺氧刺激啟動(dòng)修復(fù)過程、促進(jìn)細(xì)胞存活的保護(hù)性機(jī)制，對(duì)于經(jīng)歷了缺血/再灌注損傷的神經(jīng)元具有保護(hù)作用。 本實(shí)驗(yàn)中，腦缺血再灌注3 h后ERK活性顯著增加，于6 h達(dá)到高峰，于72 h恢復(fù)至對(duì)照水平，ERK在神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞中均可見到，表明其發(fā)生主要與磷酸化過程有關(guān)，在神經(jīng)組織中的選擇性沒有很大差異。 缺血/再灌注損傷后組織中ERK活性變化的不一致性可能與實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物種屬，實(shí)驗(yàn)方法及腦缺血/再灌注時(shí)間的不同等有關(guān)。 就目前的研究結(jié)果分析： 缺血/再灌注損傷可使組織細(xì)胞的ERK迅速激活，作為早期細(xì)胞內(nèi)信號(hào)參與了細(xì)胞對(duì)這一應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)。

　　細(xì)胞凋亡是程序性決定基因表達(dá)的結(jié)果。 在大鼠腦缺血/再灌注模型中凋亡發(fā)生最顯著的部位是缺血周圍區(qū)（缺血半影區(qū)）及缺血敏感區(qū)（如海馬）等部位。 大鼠缺血再灌注24～48 h凋亡的細(xì)胞最多。 已有充分的證據(jù)說明MAPK途徑在神經(jīng)元凋亡中起重要作用。 大鼠局灶性腦缺血20 min或2 h后再灌注12～24 h，在IP區(qū)可見到典型的細(xì)胞凋亡特征和大量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，并且凋亡細(xì)胞因缺血損傷程度的不同而分布不同［7］。 Fukunaga等［8］用BDNF等刺激培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)細(xì)胞可通過以RAS/Raf1/MAPK為主的傳導(dǎo)通路激活cfos基因。 使用細(xì)胞周期依賴性激酶MAPK的抑制劑可防止神經(jīng)元因撤除神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)所致的凋亡。 本實(shí)驗(yàn)中，缺血/再灌注3 h開始凋亡細(xì)胞，于48 h達(dá)到高峰，72 h以后凋亡細(xì)胞有逐漸減少。 可以認(rèn)為ERK激活的發(fā)生和出現(xiàn)時(shí)間較早于凋亡，一方面提示它是凋亡前細(xì)胞破壞的酶釋放過程；另一方面，凋亡的發(fā)生可能有ERK的參與，所以較凋亡為早，應(yīng)用此指標(biāo)可以預(yù)測(cè)和檢測(cè)凋亡的發(fā)生和程度。

　　局灶性和全腦缺血后，ERK在存活的神經(jīng)元中活性增加，但在死亡的神經(jīng)元中活性降低。 本實(shí)驗(yàn)中在腦缺血/再灌注72 h，神經(jīng)細(xì)胞大量死亡，所以ERK活性有所降低，較sham組無(wú)大差異。 此結(jié)果表明ERK的變化有固定的時(shí)間過程，不是一個(gè)持續(xù)的過程。 這一結(jié)果提示在較早時(shí)間內(nèi)進(jìn)行有效干預(yù)（恢復(fù)缺血）可以阻止缺血再灌注后腦損傷的級(jí)聯(lián)過程，為臨床治療提供了一個(gè)時(shí)間窗。

　　對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷后不同部位腦組織ERK表達(dá)的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，對(duì)缺血耐受性強(qiáng)的海馬CA3/DG區(qū)ERK活性的增加較對(duì)缺血敏感的CA1區(qū)明顯，隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，CA3/DG區(qū)ERK活性雖有降低，但是，再灌注24 h時(shí)仍高于對(duì)照水平，而CA1區(qū)ERK活性隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，很快降至對(duì)照水平以下。 作者同時(shí)檢測(cè)了膜蛋白的酪氨酸磷酸化，發(fā)現(xiàn)CA3/DG區(qū)180KD膜蛋白（生長(zhǎng)因子受體）的磷酸化再灌注后24 h持續(xù)增加，分析此變化可能為缺血刺激引起的膠質(zhì)細(xì)胞釋放生長(zhǎng)因子所致［9］。 ERK部位差別的意義： 皮層下/皮層及多部位均可見到。 這主要與灌注和血流分布有關(guān)。 灌注越多的地方發(fā)生ERK改變?cè)蕉唷?提示它的改變是I/R的直接作用結(jié)果，其I/R和ERK升高是可能是一個(gè)短環(huán)路，即ERK是一個(gè)直接的灌注應(yīng)答指標(biāo)。

　　總之，ERK傳導(dǎo)通路在局灶性腦缺血后被激活，并在缺血性組織損傷中發(fā)揮重要作用，過量的ERK激活能引起大鼠海馬神經(jīng)元凋亡發(fā)生，加重腦缺血再灌注損傷。 針對(duì)ERK的變化規(guī)律，進(jìn)行有效干預(yù)可望為急性缺血性腦卒中提供一個(gè)新的路徑。

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