[實驗目的]

　　1.了解細胞轉染技術原理和基本方法

　　2.磷酸鈣沉淀法的基本技術要點

　　[實驗原理]

　　磷酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復合物的一種將DNA導入真核細胞的轉染方法，磷酸鈣被認為有利于促進外源DNA與靶細胞表面的結合。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲作用進入靶細胞，被轉染的DNA可以整合到靶細胞的染色體中從而產生有不同基因型和表型的穩(wěn)定克隆。這種方法首先由Graham和van der Ebb使用，后由Wigler修改而成?？蓮V泛用于轉染許多不同類型的細胞，不但適用于短暫表達，也可生成穩(wěn)定的轉化產物。

　　[儀器、材料和試劑]

　　1.呈指數(shù)生長的真核細胞（如HeLa，BALB/c 3T3，NIH 3T3，CHO，或鼠胚胎成纖維細胞）

　　2.完全培養(yǎng)液（依所用的細胞系而定）

　　3.CsCl純化的質粒DNA （10～50μg/次轉染，二次純化）

　　4.2×HEPES緩沖鹽水（HeBS）

　?。╬H6.95～7.05）。50.0mmol/L HePes；280mmol/L NaCl；10mmol/L KCl；1.5mmol/L葡萄糖。用0.5mmol/L NaOH調pH至6.95～7.05，過濾除菌后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/P>

　　5.2.5mol/L CaCl2過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/P>

　　6.磷酸緩沖鹽水（PBS）

　　7.37℃，5%CO2的加濕培養(yǎng)箱

　　8.100mm組織培養(yǎng)平板

　　9.15ml錐形管

　　[方法與步驟]

　　1.傳代細胞準備。細胞在轉染前24h傳代，待細胞密度達50%～60%滿底時即可進行轉染。加入沉淀前3～4h，用9ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。

　　2.DNA沉淀液的準備。首先將質粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm平板），空氣中晾干沉淀，將DNA沉淀重懸于μL無菌水中，加50μL2.5mol/L CaCl2。醫(yī)學教育網

　　3.用巴斯德吸管在500μL.2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同時用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整個過程需緩慢進行，至少需持續(xù)1～2min。

　　4.室溫靜置30min，出現(xiàn)細小顆粒沉淀。

　　5.將沉淀逐滴均勻加入10cm平板中，輕輕晃動。

　　6.在標準生長條件下培養(yǎng)細胞4～16h.除去培養(yǎng)液，用5ml.1×HeBS洗細胞2次，加入10ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。

　　7.收集細胞或分入培養(yǎng)皿中選擇培養(yǎng)。

　　[注意事項]

　　1.在整個轉染過程中都應無菌操作。

　　2.為獲得最佳實驗結果，DNA應不含蛋白質和酚。乙醇沉淀后的DNA應保持無菌，并在無菌水或Tris EDTA中溶解。

　　3.沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2溶液時需用空氣吹打，以確保形成盡可能細小的沉淀物，因為成團的DNA不能有效地粘附和進入細胞。

　　4.在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質量，因為甚至偏離最優(yōu)條件十分之一個pH都可能導致磷酸鈣轉染的失敗。