大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化

　　第一節(jié) 概 述

　　在自然條件下，很多質(zhì)粒都可通過細菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進受體細菌，需誘導(dǎo)受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA.

　　轉(zhuǎn)化（Transformation）是將外源DNA分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。

　　轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體（Rˉ，Mˉ），它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細胞經(jīng)過一些特殊方法（如電擊法，CaCl2 ，RbCl（KCl）等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞（Compenent cells）。進入受體細胞的DNA分子通過復(fù)制，表達實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子（Transformant，即帶有異源DNA分子的受體細胞）。目前常用的感受態(tài)細胞制備方法有CaCl2和RbCl（KCl）法，RbCl（KCl）法制備的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率較高，但CaCl2 法簡便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實驗的要求，制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時，可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法為使用更廣泛。

　　為了提高轉(zhuǎn)化效率， 實驗中要考慮以下幾個重要因素：

　　1. 細胞生長狀態(tài)和密度： 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于4℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時，細胞密度在5×107 個/ml左右（不同的菌株情況有所不同），這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。

　　2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度： 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA（cccDNA）。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，轉(zhuǎn)化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細胞體積的5％。

　　3. 試劑的質(zhì)量： 所用的試劑，如CaCl2 等均需是最高純度的（GR.或AR.），并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。

　　4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行， 所用器皿， 如離心管， tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染， 否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入， 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。

　　本實驗以E.coli DH5a菌株為受體細胞，并用CaCl2處理，使其處于感受態(tài)，然后與pBS質(zhì)粒共保溫，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因（Ampr ），可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pBS.轉(zhuǎn)化子擴增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。

　　本實驗以E.coli DH5a菌株為受體細胞，并用CaCl2處理，使其處于感受態(tài)，然后與pBS質(zhì)粒共保溫，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因（Ampr ），可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pBS.轉(zhuǎn)化子擴增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。

　　第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑

　　一。 材料

　　E. coli DH5α菌株： Rˉ，Mˉ，Ampˉ；pBS質(zhì)粒DNA： 購買或?qū)嶒炇易灾?，eppendorf管。

　　二。 設(shè)備

　　恒溫搖床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，臺式高速離心機，無菌工作臺，低溫冰箱， 恒溫水浴鍋， 制冰機， 分光光度計，微量移液槍。

　　三。 試劑

　　1.LB固體和液體培養(yǎng)基：配方見第一章。

　　2.Amp母液：配方見第一章。

　　3.含Amp的LB固體培養(yǎng)基：將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右，加入Amp儲存液，使終濃度為50ug/ml，搖勻后鋪板。

　　4.麥康凱培養(yǎng)基（Maconkey Agar）：取52g麥康凱瓊脂，加蒸餾水1000ml，微火煮沸至完全溶解，高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲存液使終濃度為50ug/ml，然后搖勻后涂板。

　　5.0.05mol/L CaCl2溶液：稱取0.28g CaCl2（無水，分析純），溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高壓滅菌。

　　6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2： 稱取0.28g CaCl2（無水，分析純），溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高壓滅菌。

　　第三節(jié) 操作步驟

　　一、 受體菌的培養(yǎng)

　　從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α單菌落，接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)12小時左右，直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1：100-1：50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600 ＝0.5左右。

　　二、 感受態(tài)細胞的制備 （ CaCl2 法）

　　1、將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置10分鐘，然后于4℃下3000g離心10分鐘。

　　2、 棄去上清，用預(yù)冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞，冰上放置15-30分鐘后，4℃下3000g離心10分鐘。

　　3、棄去上清，加入4ml預(yù)冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細胞懸液。

　　4、 感受態(tài)細胞分裝成200μl的小份，貯存于-70℃可保存半年。

　　三、 轉(zhuǎn)化

　　1、從-70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。

　　2、 加入pBS質(zhì)粒DNA溶液（含量不超過50ng，體積不超過10μl），輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后。

　　3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。

　　4、向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基（不含Amp），混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時，使細菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（Ampr ）。

　　5、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)16-24小時。

　　同時做兩個對照：

　　對照組1： 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液，其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)。

　　對照組2： 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液，但涂板時只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。

　　四、 計算轉(zhuǎn)化率

　　統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。

　　轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：

　　轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積／涂板菌液體積

　　轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)／每mg質(zhì)粒DNA）＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量（mg）

　　感受態(tài)細胞總數(shù)＝對照組2菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積／涂板菌液體積

　　感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細胞總數(shù)

　　[注意] 本實驗方法也適用于其它E.coli受體菌株的不同的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化。但它們的轉(zhuǎn)化效率并不一定一樣。有的轉(zhuǎn)化效率高，需將轉(zhuǎn)化液進行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板，而有的轉(zhuǎn)化效率低，涂板時必須將菌液濃縮（如離心），才能較準確的計算轉(zhuǎn)化率。