抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用：

免疫動物

（1）抗原：免疫動物是制備抗血清的第—步。免疫所用的抗原可用病毒、細(xì)菌或者其他蛋白質(zhì)抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必須與大分子載體連接?？乖挠昧恳暱乖N類及動物而異，—次注射小鼠可以少至幾個微克，免、羊甚至更大的動物每次注射的量就相應(yīng)增加，從幾百μg/次至幾mg/次。

〔2）佐劑及乳化：佐劑可以幫助抗原在注射部位緩慢釋放，以增加免疫刺激的效果。佐劑有完全和不完全佐劑之分。完全佐劑加有滅活的分枝桿菌（如卡介苗）或棒狀桿菌。福氏佐劑可從試劑公司購買，也可用羊毛脂和石蠟油按1：2—4混合自行制備。佐劑與抗原按1：1的比例混合乳化為均勻的乳液，放置后不會發(fā)生油水分離。

（3）免疫動物：常用于制備抗血清的動物打豚鼠、家免、小鼠、大鼠等，如果大量生產(chǎn)可用動物羊、馬等，動物接受免疫的乳液量小鼠為1.0—2.0mL，家兔為2—4mL.抗原免疫動物的途徑取決于動物種類、抗原特性和是否使用佐劑。腹腔注射（i.p），肌肉注射（i.m），皮內(nèi)注射（i.d.）和皮下注射（s.c.）適合于任何抗原，這些途徑主要刺激局部淋巴結(jié)發(fā)生免疫應(yīng)答，初次免疫和免疫加強注射均可使用。靜脈注射（i.v.）則只適合于可溶性抗原及分散的單細(xì)胞懸液，且不能使用佐劑，其誘發(fā)的免疫應(yīng)答主要發(fā)生在脾臟。此外，在單克隆抗體制備時，亦可用脾臟直接注射或體外免疫方法，尤其對微量抗原比較實用。體外免疫方法也常用于人源單克隆抗體的制備。體外免疫時將脾細(xì)胞或外周血淋巴細(xì)胞（包括B細(xì)胞，T細(xì)胞及抗原遞呈細(xì)胞）與抗原一起作體外培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細(xì)胞融合。初次免疫后要經(jīng)過2—3次以上的免疫加強以保證能形成較高水平的IgC抗體。兩次免疫注射之間的時間間隔，一般3—4周比較適合大部分動物，小動物可間隔10—14d，大動物則在2月左右。在免疫加強最后一次注射后的一周內(nèi)采集抗血清，可獲得高水平的抗體。

抗血清的純化與保存

（1）采血：加強免疫的動物2—3次后，可通過耳靜脈或眼球（小鼠）采血，進(jìn)行抗血清效價測定。當(dāng)效價達(dá)到理想的高度后，可以采血。采血方式可以從心臟直接取血，也可通過動脈放血。待血液凝固后用針筒或吸管吸取血清。

（2）抗血清的純化與保存：除抗體外血清中含有多種其他蛋白成分。為了避免這些蛋白質(zhì)干擾抗體（免疫球蛋白）標(biāo)記反應(yīng)和抗原抗體反應(yīng)，抗血清可經(jīng)過純化以獲得單一的機體（常為IgG）組分。常用的純化IgG的方法為飽和硫酸胺鹽析和層析法。蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度的溶液中，其溶解度不一樣，鹽離子干擾蛋白質(zhì)和水分子間氫鍵形成，因為水—鹽結(jié)合比水—蛋白質(zhì)結(jié)合更穩(wěn)定，蛋白質(zhì)即可從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)分子越大，沉淀時所需鹽離子濃度越低。免疫球蛋白（Mr1.5×105）比血清中主要蛋白質(zhì)白蛋白（Mr6.7×104）的分子大得多，抗體在30%—50%飽和度的硫酸鹽中析出，而白蛋白需在70%—80%飽和度才析出，因此常用33%飽和度的硫酸胺純化血清中的IgG.鹽析時為了減少抗體變性，需在4℃進(jìn)行，同時用pH8.0緩沖液稀釋抗血清，以減少蛋白濃度過高而發(fā)生共沉淀。銨鹽的溶解度不隨溫度變化而明顯改變，0℃和25℃僅差3%，而鈉鹽則相差5倍，因此常在低溫沉淀時用銨鹽，室溫沉淀用鈉鹽。銨鹽對抗體的標(biāo)記反應(yīng)（如FITC和biotin標(biāo)記時）有一定的干擾作用。

鹽析法只能部分純化抗體，更高純度的抗體制劑可用層析法制備。IgM五聚體相對分子質(zhì)量達(dá)9.7×10，比血清中任何其他蛋白都大，用分子篩層析很容易將其純化。IgG在PH8.0時帶負(fù)電荷，能與DEAE纖維素上的陽離子結(jié)合，因此可用離子交換層析來純化IgG.IgG純化最常用的方法為親和層析。IgG與葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白具合高度的親和性，可用這兩種蛋白質(zhì)交聯(lián)親和層析柱將IgG純化。大部分IgG與蛋白A結(jié)合PH為8—9，洗脫PH為2—4；而與蛋白G的結(jié)合PH為5—7，洗脫PH為9—10.C蛋白更適合于IgG的純化，不但反應(yīng)條件為溫和的弱酸性或弱堿性，并且與IgG的結(jié)合力高于A蛋白。G蛋自能與大部分動物種類的IgG結(jié)合，而A蛋白對小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、馬和綿羊IgG結(jié)合力弱或不能結(jié)合G蛋白和A蛋白均不能與雞IgG結(jié)合。

抗血清或純化的抗體在低溫保存可維持活性數(shù)年，反復(fù)凍融使抗體很快失活，被細(xì)菌或霉菌污染的抗血清或IgG制品也易失去活性。稀釋的抗血清加入防腐劑疊氮化鈉和保護劑如BSA等可于4℃保存。長期保存常用等量甘油于—20℃以下冷藏。也可置于50%飽和硫酸銨中4℃保存，還可以冷凍干燥保存。

抗血清的特性鑒定

根據(jù)不同目的制備的抗血清，對其中所含抗體的濃度，特異性及免疫球蛋白種類的要求也不一樣。為了獲得質(zhì)量和數(shù)量上合符要求的抗血清，在收集動物血清前必須對免疫效果進(jìn)行檢測，對收獲后的抗血清也必須對—些參數(shù)進(jìn)行分析，如效價、親和力及交叉反應(yīng)等。根據(jù)不同的抗原性質(zhì)選用合適的檢測方法。最常用的為免疫沉淀，ELISA，放射免疫等。

效價又稱滴度（titer），是常用于表達(dá)抗血清中特異性抗體相對含量的—個半定量指標(biāo)，即在給定的條件下，結(jié)合—定量抗原的抗血清的稀釋度?？寡褰?jīng)一系列稀釋后（如倍比稀釋）與定量的抗原反應(yīng)，以能檢測抗血清最大稀釋倍數(shù)即為該抗血清的效價。不同的檢測方法測定同一種抗血清的效價，靈敏度不一樣，抗血清的效價也不一樣，如沉淀反應(yīng)（瓊脂雙擴散）與ELISA二者的效價相差甚大，后者遠(yuǎn)高于前者。放射免疫分析（RIA）常用于標(biāo)記小分子抗原來檢測抗血清的效價。

親和力（affinity）表示抗血清與相應(yīng)抗原的結(jié)合強度，是描述抗體持異性的重要指標(biāo)，

常用親和常數(shù)K表示。親和常數(shù)K與抗原抗體反應(yīng)的平衡常數(shù)有關(guān)：

抗體特異性與交叉反應(yīng)：抗體是特異的。只與相應(yīng)抗原反應(yīng)。實際制備的抗體卻常有非特異性反應(yīng)，這是因為抗原不純造成的。多組分抗原之間存在共同的抗原決定簇，或者兩個抗原決定簇結(jié)構(gòu)類似能與同一抗體結(jié)合，均可出現(xiàn)抗體與異源抗原的交叉反應(yīng)。用瓊脂雙擴散能簡便直觀地反映不同抗原與同一抗血清，或不同抗血清與同一抗原的交叉反應(yīng)。

單克隆抗體的制備

原理1：單克隆抗體（MAb）與抗血清（又稱多克隆抗體，PAb）最主要的區(qū)別是MAb為單一種B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的一種均一的免疫球蛋白分子。所以MAb是B細(xì)胞克隆的標(biāo)志，是一種獨特型的抗體，它的特異性是針對一個抗原決定簇的。制備單克隆抗體不能用化學(xué)分離的方法從多克隆抗體中去分離純化得到它，而是用分離產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞克隆的方法得到它。為了使B細(xì)胞克隆能在體外人工培養(yǎng)下長期存活并產(chǎn)生完全均一的MAb，G.KÖ；hler合Milstein于1975年創(chuàng)立了雜交瘤方法。所以制備單克隆抗體的技術(shù)又稱雜交瘤技術(shù)（hybredomatechnique）。

雜交瘤技術(shù)的基本原理是用分泌抗體但不能長期培養(yǎng)的B細(xì)胞與能在體外長期培養(yǎng)并可低溫保存的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行雜交。篩選得到的雜交瘤細(xì)胞應(yīng)該是既能分泌抗體又有瘤細(xì)胞的特性，可長期傳代培養(yǎng)，又可在液氮中保存的細(xì)胞。把這些細(xì)胞單克隆化，用單克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆抗體的生產(chǎn)。

原理：最常用的單克隆抗體是小鼠的單抗，此外也有大鼠的和人源的單抗。人源單抗制備比較復(fù)雜。小鼠單抗的制備通常是使用Balb/c小鼠的B細(xì)胞和它的骨髓瘤細(xì)胞。大鼠的單抗制備通常用Lou/c大鼠及其骨髓瘤和Y3/AO大鼠及其骨髓瘤細(xì)胞。B細(xì)胞是從免疫動物的脾臟中分離出來的。動物免疫方法與抗血清制備相同，只是在制備脾臟前3d必須進(jìn)行一次靜脈加強注射以保證得到的B細(xì)胞有旺盛的分泌抗體的活性。骨髓瘤細(xì)胞有許多細(xì)胞株是經(jīng)過誘變和篩選得到的缺陷型。篩選的標(biāo)準(zhǔn)是①瘤細(xì)胞本身不產(chǎn)生抗體或者產(chǎn)生抗體的某種鏈，但不能分泌；②是次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型。因為這種缺陷型的瘤細(xì)胞正常的核酸合成途徑被氨基喋吟（aminopterin）阻斷后，由于缺失這些酶，即使補充它的底物次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T），核酸合成的旁路也不能起到救援的作用，結(jié)果導(dǎo)致瘤細(xì)胞死亡（圖7—2）。而雜交瘤細(xì)胞因帶有B細(xì)胞的全套基因，在HAT存在的條件下借助于HGPRT和TK的作用通過替代的核酸合成途徑能正常合成DNA和RNA.所以雜交瘤能正常地生長繁殖而被選擇出來。未被融合的游離的B細(xì)胞只能存活3d而后自行死亡。這就是用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行選擇的原理。

細(xì)胞雜交與選擇培養(yǎng)

（1）融合：細(xì)胞雜交之前，要分別準(zhǔn)備好脾臟的B細(xì)胞懸液和小鼠骨髓瘤細(xì)胞（如SP2/0—Agl4細(xì)胞株）。免疫后的小鼠脾臟在無菌條件下破碎，將B細(xì)胞懸浮在沒有血清的培養(yǎng)液中（通常使用RPMIl640商品配制），并洗滌3次去掉小鼠的血清。SP2/0細(xì)胞是用加有10%胎?；蛐∨Ｑ迮囵B(yǎng)的，每天更換新鮮培養(yǎng)液使成為對數(shù)分裂期生長旺盛的細(xì)胞。細(xì)胞用RPMIl640洗滌2—3次，把兩種細(xì)胞合并在同—試管中，用50%的聚乙二醇（相對分子質(zhì)量為1000—1500）作為融合劑，在37℃條件下融合l—2min.然后用1640培養(yǎng)液緩慢稀釋，然后除去PEG，將細(xì)胞分散至HAT選擇培養(yǎng)板中。電融合方法也可用于單克隆抗體制備，雖融合率較高，但一次融合的細(xì)胞數(shù)少，且需專門設(shè)備，故限制了其廣泛使用。融合時脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的比例在5：1—10：1均可獲得滿意結(jié)果，每次融合細(xì)胞數(shù)量在10—10較為合適。融合后的細(xì)胞在40或96孔板上的HAT培養(yǎng)液（RPMIl640含10%—20%胎?；蛐∨Ｑ搴虷AT）中37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。融合后的細(xì)胞懸液中只有脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)基中生長，其他形式的融合細(xì)胞均不能生長。未融合的細(xì)胞也不能在HAT培養(yǎng)液中生存。

在融合后的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，飼養(yǎng)細(xì)胞（feedercell）有助于雜交瘤細(xì)胞的生長。飼養(yǎng)細(xì)胞可用同種動物的腹腔細(xì)胞或胸腹細(xì)胞。腹腔細(xì)胞中的吞噬細(xì)胞能清除死亡細(xì)胞碎片。使背景更為清潔“干凈”。同時飼養(yǎng)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或活性物質(zhì)有助于雜交瘤細(xì)胞的生長?，F(xiàn)有商品“雜交瘤細(xì)胞生長因子”可用于替代飼養(yǎng)細(xì)胞。

（2）陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選與單克降化：雜交細(xì)胞經(jīng)約10—14d培養(yǎng)后，形成可用的細(xì)胞集落（克?。?。經(jīng)過幾次更換培養(yǎng)液（HT培養(yǎng)液）后進(jìn)行抗體活性檢測。常用的篩選槍測方法是ELISA和凝集試驗，前者常用于可溶性抗原，后者適用于細(xì)胞、細(xì)菌等表面抗原。此外，Dot－ELISA、免疫印跡及免疫熒光試驗均可用于雜交瘤細(xì)胞的篩選。

使許多細(xì)胞克隆混合生長的細(xì)胞分離為單個的細(xì)胞克隆的過程稱克隆化（colonization）最常用的單克隆化方法是有限稀釋法（limiteddilution），即將混合細(xì)胞經(jīng)稀釋后分裝于培養(yǎng)板上，使培養(yǎng)板的大部分孔中只出現(xiàn)一個細(xì)胞。為了確保抗體分泌細(xì)胞來源于單個細(xì)胞，克隆化過程可重復(fù)進(jìn)行，稱為亞克隆化（subclonization）。除有限稀釋法外，熒光激活細(xì)胞分揀法（FACS）也用于雜交瘤細(xì)胞的克隆化過程。

單克隆抗體的擴大生產(chǎn)

產(chǎn)生特異性抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴大培養(yǎng)，以獲得足夠的細(xì)胞用于保存和生產(chǎn)可供應(yīng)用的抗體。生產(chǎn)大量單克隆抗體的方法目前常用的有3種：小鼠腹水制備、大瓶培養(yǎng)和中空纖維反應(yīng)器，前者多用于實驗室制備，后二者適應(yīng)于工廠化生產(chǎn)。

腹水制備：雜交骨髓瘤細(xì)胞在腹腔中定植，并產(chǎn)生大量腹水。選用與單克隆抗體制備所用相同的動物品系或者含有相同基因的Fl代雜交品系。雜交F1代品系更適合于腹水制備，如果用異源動物制備腹水時可選用無MHC限制性的裸鼠。用小鼠制備腹水時，先用礦物油或Pristane致敏，以抑制其免疫功能，利于腹水的形成。腹腔注射10—10個雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過7—10d后形成腹水。每只小鼠可獲得3—5mL腹水，每mL含IgG抗體可達(dá)5—10mg.腹水中含有較多的雜蛋白和非特異性IgG，并且含有許多蛋白酶，易使抗體失活，因此腹水收集后應(yīng)盡快純化，以防止降解。

大瓶培養(yǎng)：采用1000mL或更大的搖瓶培養(yǎng)。大瓶培養(yǎng)上清體積大，但抗體濃度低，給抗體純化帶來很大困難，消耗人力和培養(yǎng)液，增加生產(chǎn)成本。

中空纖維反應(yīng)器：是比較經(jīng)濟的單克隆抗體生產(chǎn)方法。該裝置由具有半透膜性質(zhì)的成束的微孔纖維組成，雜交瘤細(xì)胞位于纖維外部的小量培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液在纖維的微孔中循環(huán)，供給營養(yǎng)和帶走廢物，抗體大分子和小分子化合物被隔開。高密度的雜交瘤細(xì)胞能在此系統(tǒng)中維持?jǐn)?shù)月，每天可產(chǎn)生數(shù)百毫克的抗體，抗體濃度高，體積小易于純化。

胎（?。┡Ｑ逡恢笔羌?xì)胞培養(yǎng)所必須的，在單克隆抗體生產(chǎn)過程中培養(yǎng)液中的血清蛋白使抗體的純化增加了困難，近年開發(fā)的無血清培養(yǎng)技術(shù)已逐漸用于單克隆抗體的生產(chǎn)中。

人單克隆抗體的制備

小鼠的單克隆抗體蛋白應(yīng)用于人體后，作為抗原能引起人的免疫應(yīng)答，大大降低其生物活性，并可能導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)。因此人源單克隆抗體在臨床治療上有廣泛應(yīng)用前景，引起人們的普遍興趣。但是人單克隆抗體制備存在許多技術(shù)上和倫理上的障礙，如人雜交瘤細(xì)胞系不穩(wěn)定，有些抗原不能對人進(jìn)行人工免疫，人B細(xì)胞只能從外周血中分離而無法從脾臟取得等。盡管如此，一些人源單克隆抗體已經(jīng)獲得，技術(shù)上也在逐步完善起來。

人的瘤細(xì)胞株U—266常用來與人外周血B細(xì)胞融合以獲得人源單克隆抗體。另一些淋巴母細(xì)胞抹（LCL）則來源于EB病毒轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞，如GMl500，W1—L2和ARH77等也用于雜交瘤細(xì)胞的制備。這些細(xì)胞系表現(xiàn)ED病毒核抗原（EBNA）陽性，且形成的雜交瘤細(xì)胞抗體的分泌水平不高。

獲得人單克隆抗體的另一方法是用EBV直接轉(zhuǎn)化某些抗體分泌細(xì)胞，使之成為“不死”的細(xì)胞在體外培養(yǎng)。EBV感染人B細(xì)胞后，病毒基因插入人B細(xì)胞基因組中，有1%的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為“不死”的細(xì)胞。B細(xì)胞轉(zhuǎn)化可通過“病毒驅(qū)動”和“細(xì)胞驅(qū)動”兩種方法獲得。前者是將B細(xì)胞與分泌EBV的B95—8細(xì)胞系一同培養(yǎng)，后者則是與EBNA陽性的LCL細(xì)胞一同培養(yǎng)。“細(xì)胞驅(qū)動”轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞比較穩(wěn)定，抗體分泌能力也較強。

人淋巴母細(xì)胞系和人雜交瘤細(xì)胞較難獲得，人單克隆抗體也可以通過異源雜文的辦法制備，即將EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，將獲得的異源雜交瘤細(xì)胞再與免疫后的B細(xì)胞融合，得到人單克隆抗體分泌細(xì)胞，不產(chǎn)生自身免疫球蛋白，EBVA也是陰性。

基因工程抗體的制備

抗體的化學(xué)修飾：

抗體Fc段用雙功能連接劑與熒光素，同位素，酶，發(fā)光化合物，稀土元素以及藥物，毒素等連接后，并不影響其Fab功能區(qū)與特異性抗原結(jié)合。根據(jù)交聯(lián)物的性質(zhì)不同，標(biāo)記的抗體可用作診斷試劑，也可作為藥物的定向載體，引導(dǎo)藥物或毒素到達(dá)抗原存在部位使藥物或使毒素發(fā)揮更有效的作用，即俗稱“生物導(dǎo)彈”。從而減少藥物、毒素、同位素、酶在腫瘤治療過程中引起嚴(yán)重的副作用，大大提高治療腫瘤的效果。

許多毒素如蓖麻毒素，白喉毒素，天花粉，紅豆毒素等均為蛋白質(zhì)或糖蛋白，可用雙功能劑與抗體相連；嗎啡，前列腺素，氨甲喋吟，磷酸酯酶C等含有羧基能用碳二亞胺（EDC），混合酸酐法與抗體的氨基形成酰胺鍵；同樣，含脂肪胺的藥物如慶大雷素，阿霉素在水溶性EDC的作用下與抗體的羧基連接；而含芳香胺的藥物則先在低溫下與亞硝酸作用形成重氮化合物，再與抗體分子上的酪氨酸或組氨酸殘基形成偶氮鍵?？傊ㄟ^抗體的化學(xué)修飾把抗體的特異性用到定向給藥和定位檢測上。

抗體基因文庫

抗體基因文庫（antibodyrecombinationlibrary）是將不同的重鏈和輕鏈基因隨機組合，克隆到合適的表達(dá)載體中，在原核細(xì)胞表達(dá)不同的抗體，形成一個抗體庫，從這個抗體庫中，用抗原可以篩選到相應(yīng)的抗體基因?？贵w基因來源于雜交瘤細(xì)胞或動物B細(xì)胞（免疫或未免疫）的DNA和mRNA.

用質(zhì)粒作為抗體文庫的載體，雖然也可能表達(dá)有活性的抗體分子或片段，但由線狀噬菌體表達(dá)更為方便有效。M13、fd、F1等噬菌體的外殼蛋白由5種蛋白組成：pⅢ、pⅥ、pⅦ、pⅧ和pⅨ。每種含量不一，其中pⅧ含量最多，每個噬菌體有2700個pⅧ亞基，其余4種蛋白僅5個拷貝。增加噬菌體外殼蛋白的長度并不影響噬菌體的裝配，抗體以融合蛋白的形式表達(dá)于噬菌體表面。噬菌體表達(dá)質(zhì)粒常用的有fd－CAT1、fd－tet－DOG1、PHEN1、pComb3和pComb3H等?？贵w融合蛋白構(gòu)建多用pⅢ和pⅧ，pⅧ拷貝數(shù)高，低親和力的抗體蛋白容易篩選出來。

在噬菌體表達(dá)抗體時，常常不表達(dá)完整的抗體分子，（因為CH2上不能進(jìn)行糖基化）。根據(jù)不同的引物得到重鏈的VH或VHCH1區(qū)，輕鏈的VL或VLCL區(qū)。VL和VH兩個片段用一短肽作連接片段，形成單鏈可變區(qū)（single－chainfragmentvariable，scFv）；VHCH1和VLCL兩片段則形成Fab片段。另外，單獨的VH和VL也能結(jié)合抗原，如果二者形成同源或異源二聚體（dAb），則穩(wěn)定性和親和性明顯提高（圖7—4）。此外在抗體片段DNA末端加上一些功能蛋白（如堿性磷酸酶和蛋白毒素）的基因，則表達(dá)的抗體就帶有一定生物活性功能片段，可用于檢測或治療。如果在抗體基因末端加上終止子（TAG）則表達(dá)的抗體片段是可溶性的，而不是結(jié)合在噬菌體表面。

用特異性抗原免疫的動物B細(xì)胞構(gòu)建抗體的噬菌體文庫，抗體親和性高，用與免疫抗原不同的抗原篩選得到的抗體親和性普遍較低?？捎媚M天然體細(xì)胞突變的方法來提高親和力。如混雜重組法，即將己獲得的輕鏈或重鏈的V片段切下，再克隆至隨機的文庫中的V區(qū)構(gòu)成二級文庫，使H鏈和L鏈混雜，可以使抗體片段的親和性提高。利用PCR錯配將隨機突變引人至抗體的抗原結(jié)合區(qū)，也能提高對抗原的親和力。先用低親和力的載體在噬菌體的PⅧ表達(dá)，篩選后、將抗體基因片段PCR擴增轉(zhuǎn)至PⅢ上表達(dá)，可獲得高親和力的抗體片段。

抗體基因文庫有兩個優(yōu)點，一是從不適合進(jìn)行人工免疫的物種獲得單克隆抗體，如人源單克隆抗體；二是可快速方便獲得單克隆抗體。

抗體基因的改造

將鼠源抗體的V區(qū)基因與人源抗體C區(qū)基因重組，獲得的嵌合抗體（chimericalantibody），可保留鼠抗體對抗原的高親和性，又減弱鼠源抗體對人的免疫原性，提高治療性抗體的效果。

重組的嵌合抗體基因轉(zhuǎn)化骨髓瘤細(xì)胞或中國地鼠卵細(xì)胞（CH0），可在其中表達(dá)。為了進(jìn)一步地消除鼠抗體V區(qū)框架區(qū)（FW）的異源性，可實行CDR移植（CDRgrafting），以獲得與鼠FW類似的人FW結(jié)構(gòu)的嵌合抗體。

噬菌體表達(dá)的抗體僅含V區(qū)（scFv）或Fab片段，缺乏Fc區(qū)，使抗體的穩(wěn)定性下降，半衰期縮短，與Fc受體結(jié)合功能也消失。因此在抗體功能片段的末端連接A蛋白、酶、細(xì)胞因子、CD4和毒素等分子，既可增加抗體片段的穩(wěn)定性，又可發(fā)揮某些生物學(xué)活性功能。

用抗體基因工程方法獲得的抗體與效應(yīng)分子交聯(lián)物比用化學(xué)交聯(lián)法具有優(yōu)點：可以大量生產(chǎn)，不會因修飾作用影響抗體及效應(yīng)分子的活性，效應(yīng)分子還可根據(jù)需要進(jìn)行改造。

此外在抗體片段的末端連接一段特異的雙親性螺旋（amphiphilichelixes）結(jié)構(gòu)，如亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（leucinezipper），可使單價的scFv或Fab片段在體內(nèi)或體外形成穩(wěn)定的雙分子聚合體，從而提高抗體片段的親和力。此法也可用于制備雙特異性抗體。

基因工程抗體在真核細(xì)胞中的表達(dá)

噬菌體表達(dá)的抗體片段常常是在原核細(xì)胞（E.coli）中完成。原核系統(tǒng)表達(dá)抗體片段產(chǎn)量

高，成本低，快速易于操作。但抗體片段在原核表達(dá)系統(tǒng)中不能進(jìn)行CH2糖基化，從而影響抗體的活性。因此重組抗體基因片段可轉(zhuǎn)移至適合的骨髓瘤細(xì)胞系或哺乳動物細(xì)胞系（如CHO），甚至于植物細(xì)胞中表達(dá)，可以得到與淋巴細(xì)胞表達(dá)相同的抗體分子。免疫球蛋白IgA的重鏈和輕鏈及分泌片基因可以分別轉(zhuǎn)化不同的植株，將表達(dá)這些蛋白的植株進(jìn)行有性雜交，在雜交后代中可以裝配成完整的IgA雙分子。以植物作為生物反應(yīng)器進(jìn)行抗體的表達(dá)已有許多成功的研究報道，與動物細(xì)胞相比更為經(jīng)濟，具有廣泛的應(yīng)用前景。

抗體催化的原理

1986年，由P.G.schultz和R.A.Lerner分別領(lǐng)導(dǎo)的兩個小組同時證明抗體具有催化活性。針對一個四面體帶電荷的磷酸酯半抗原產(chǎn)生的抗體，能有選擇性地催化相應(yīng)的碳酸脂和羧酸脂的水解反應(yīng)。他們將這種有催化活性的抗體稱為催化性抗體（catalyticantibody），又稱抗體酶（abozyme）。催化抗體的作用取決于底物分子水解時的轉(zhuǎn)換態(tài)（transitionstate）（圖7—5）。轉(zhuǎn)換態(tài)的分子結(jié)構(gòu)是分子活化后的一種結(jié)構(gòu)狀態(tài)，處于轉(zhuǎn)換態(tài)的分子具有最高的活化能，分子表現(xiàn)極性。處于這種狀態(tài)的分子也是最不穩(wěn)定的，能與這種分子結(jié)合的酶或者抗體會使某些化學(xué)鍵發(fā)生斷裂（如酯鍵，碳鍵，胺鍵等）起到酶解作用?？梢娍贵w酶的作用與天然的蛋白質(zhì)酶非常相似?？贵w酶也表現(xiàn)出對底物的專一性，對立體結(jié)構(gòu)的專一性。在飽和動力學(xué)與競爭性抑制方面都與常規(guī)酶相似。所以抗體酶的發(fā)現(xiàn)打破了只有常規(guī)酶才有的分子識別和加速催化反應(yīng)的傳統(tǒng)概念，為酶工程學(xué)開創(chuàng)了新的領(lǐng)域。

抗體催化的化學(xué)反應(yīng)

由抗體催化的化學(xué)反應(yīng)特異性高于酶，但催化速率低于常規(guī)的酶，只有l(wèi)0—10倍。但有一些未發(fā)現(xiàn)催化劑的反應(yīng)，如Diels—Alder反應(yīng)也能被抗體催化。常規(guī)酶一般不能催化胺鍵水解，抗體酶能使胺鍵水解的速度增加25萬倍。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)和證明的由抗體催化的化學(xué)反應(yīng)不下40種。

催化性抗體的制備

抗體酶是抗原決定簇處于轉(zhuǎn)換態(tài)結(jié)構(gòu)的抗體。因為轉(zhuǎn)換態(tài)分子極不穩(wěn)定無法制備抗體，所以催化性抗體的獲得主要是通過設(shè)計穩(wěn)定的轉(zhuǎn)換態(tài)的類似物作為半抗原，與載體蛋白交聯(lián)后，免疫動物，獲得針對半抗原的抗體，從中篩選具有催化活性的抗體。篩選催化性單克隆抗體所用的ELISA與篩選一般抗體的方法不完全一樣，應(yīng)根據(jù)催化反應(yīng)的特點而進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?。?jīng)典的方法是先篩選出與底物或半抗原結(jié)合的抗體，然后從中再篩選出有催化活力的抗體，這種方法費時費力。利用催化性抗體對底物的催化活性，對底物進(jìn)行適當(dāng)修飾，使催化反應(yīng)的產(chǎn)物可直接表現(xiàn)抗體的催化活性，這樣可以簡化檢測步驟。

轉(zhuǎn)換態(tài)類似物半抗原的設(shè)計，必須了解催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)換態(tài)模型的結(jié)構(gòu)特點。催化抗體的抗原結(jié)合位點上與轉(zhuǎn)換態(tài)互補的某些催化基團的形成，能穩(wěn)定轉(zhuǎn)換態(tài)分子。此外有人把單克隆抗體分子用化學(xué)修飾方法引入一些活性基團，提高催化性抗體的催化與親和效率。應(yīng)用噬菌體抗體文庫也可以篩選催化性抗體，可省去制備轉(zhuǎn)換態(tài)類似物的復(fù)雜過程，直接用底物從文庫中篩選有催化活性的抗體片段。如用半抗原免疫后制備的文庫或文庫經(jīng)過多次混雜重組，則可以得到更高的親和力的催化性抗體。抗獨特型抗體也用于催化性抗體的制備，用酶作為抗原免疫小鼠獲得能夠封閉酶活性位點的單克隆抗體，將這個抗體用蛋白酶除去Fc片段，用Fab免疫其他品系的小鼠或家兔，得到的抗體具有相應(yīng)的酶催化活性醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理。

從理論上看，B細(xì)胞具有全套免疫球蛋白的多樣性的胚系基因，當(dāng)然也包括有催化作用的自身抗體在內(nèi)。然而1989年P(guān)aulW.首次報道了人體的一種能催化蛋白質(zhì)水解的免疫球蛋白。它是—種自身抗體，能水解血管活性腸肽（vasoactiveintenstinalpeptide，VIP）的Glnl6—Met17鍵。用VIP作為抗原能得到有催化作用的單克隆抗體，也能催化Glnl6—Met17鍵。大約有17%的人有這種自身抗體酶，但患有氣喘的病人中該抗體與VIP的親和力比健康人高50倍。由于VIP是一種氣管松弛劑，因此有人認(rèn)為這種VIP自身抗體的長期作用可能與氣喘的過敏應(yīng)答有一定關(guān)系。由此推測除了人工設(shè)計催化抗體以及發(fā)現(xiàn)的自身催化抗體外，用篩選單抗的方法，也有可能找到所需要的催化抗體。