通過體內(nèi)外實驗，探討健脾丸的抗肝癌作用，并提示其可能的作用機制，為該方治療肝癌提供理論依據(jù)，并樹立中醫(yī)肝癌“本”是“脾虛”的觀點. 方法：1 體外實驗：運用中藥血清藥理學(xué)原理和方法，制備健脾丸含藥血清。采用四氮唑鹽（MTT）法檢測不同濃度健脾丸含藥血清對人肝癌細胞SMMC-7721作用24h、48h、72h增殖抑制作用的影響。應(yīng)用流式細胞技術(shù)(FCM）檢測不同濃度健脾丸含藥血清對人肝癌細胞SMMC-7721作用72h后細胞凋亡率和細胞周期，及細胞bcl-2和bax基因蛋白表達。2 體內(nèi)實驗：取60只昆明種小鼠，無菌條件下將小鼠肝癌細胞H22腹水瘤細胞接種到小鼠右腋皮下，0.2ml/只（2×10<'5>個細胞）。動物隨機分為5組，每組12只，化療（5-氟尿嘧啶）組每天腹腔注射0.2ml/只，即0.5mg/只；中藥低、中、高劑量組分別給予0.302g/ml,0.604g/ml，1.208g/ml灌胃，0.4ml/只；陰性對照組每日灌服生理鹽水0.4 ml/只。每日灌胃一次，連續(xù)給藥10天，于次日處死，剝離瘤組織，稱重，計算抑瘤率。取脾臟稱重，計算脾指數(shù)。采用流式細胞技術(shù)（FCM）檢測各組瘤組織細胞凋亡率和細胞周期，及細胞bcl-2和bax基因蛋白表達。采用免疫組化法觀察不同濃度瘤組織細胞形態(tài)，及bcl-2和bax基因蛋白表達情況。結(jié)果 ：1 體外實驗結(jié)果 1．1健脾丸含藥血清對肝癌細胞SMMC-7721作用24小時后，低、中、高劑量組細胞抑制率分別為：7.28%、11.44%、26.14%，與陰性對照組相比能顯著抑制肝癌細胞SMMC-7721的生長（P<0.05）。作用48小時后，低、中、高劑量細胞凋亡抑制率分別為：15.67%、20.90%、33.47%，與陰性對照組相比能顯著抑制肝癌細胞SMMC-7721的生長（P<0.05）。作用72小時后，低、中、高劑量細胞凋亡抑制率分別為：17.55%、25.47%、34.29%，與陰性對照組相比能顯著抑制肝癌細胞SMMC-7721的生長（P<0.05）。并且中藥對肝癌細胞SMMC-7721的生長抑制作用呈劑量時間依賴性。本實驗結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)中藥健脾丸能抑制肝癌細胞SMMC-7721的生長。1．2健脾丸含藥血清低、中、高劑量組作用于肝癌細胞SMMC-772172h后，G<,0>/G<,1>；期細胞比例分別為：58.800%、62.600%、67.667%；陰性對照組G<,0>/G<,1>；期細胞比例為：50.700%，各中藥組與其相比均有顯著差異（P<0.05）。S期細胞比例分別為：34.167%、24.767%、19.633%；陰性對照組S期細胞比例為：35.933%，各中藥組與其相比均無顯著差異（P>0.05）。低、中、高劑量組凋亡率分別為：6.985%、7.615%、8.883%，陰性對照組凋亡率5.688%，各中藥組與其相比均有顯著差異（P<0.05）。且細胞凋亡率隨中藥健脾丸劑量增加而升高。1.3流式細胞儀定量分析，結(jié)果顯示：健脾丸含藥血清低、中、高劑量組細胞bcl-2基因蛋白的熒光指數(shù)（FI）分別為1.059±0.0069、1.0779±0.0053、1.0422±0.0431，陰性對照組為1.1814±0.0035，各實驗組與陰性對照組相比均有顯著差異（P<0.05），且隨健脾丸含藥劑量增加蛋白表達呈降低趨勢。bax基因蛋白的熒光指數(shù)（FI）分別為1.086±0.0338、1.2024±0.0112、1.2561±0.0148，陰性對照組為1.0392±0.0208，各組與陰性對照組相比均有顯著差異（P<0.05），且隨健脾丸含藥劑量增加bax蛋白表達呈增加趨勢。2 體內(nèi)實驗結(jié)果 2．1健脾丸低、中、高組對H22移植瘤具有明顯抑制作用，各組抑瘤率分別為19.62%，39.71%，48.74%，與陰性對照組相比均有顯著差異（P<0.01），并呈劑量依賴性?；熃M抑制率為52.76%，健脾丸高劑量組與之相比無顯著差異（P>0.01）。2．2健脾丸低、中、高劑量組荷瘤小鼠的脾指數(shù)分別為：8.038±0.9318、9.778±0.8659、11.584±1.4685，化療組脾指數(shù)為：5.278±0.4226，與化療組相比有明顯差異（P<0.01）。2．3低、中、高劑量組瘤組織細胞經(jīng)流式分析儀檢測后，G<,0>/G<,1>；期細胞比例增加，分別為66.667%、76.100%、81.633%，陰性對照組為：58.400%，與對照組相比均有顯著性差異（P<0.05）。低、中、高劑量組腫瘤細胞凋亡率分別為：22.16%、28.42%、37.94%，陰性對照組為：9.660%；與陰性對照組相比均有顯著性差異（P<0.05）。5．FU組細胞凋亡率為47.71%，健脾丸高劑量組低于陽性對照組（P<0.05）。2．4健脾丸低、中、高劑量組，瘤組織細胞bcl-2基因蛋白的熒光指數(shù)（FI）分別為1.2049±0.0077、1.1423±0.0054、1.0859±0.0173，陰性對照組為1.2454±0.0052，5-FU組為1.0420±0.0682；各實驗組與陰性對照組相比均有顯著差異（P<0.01），且隨健脾丸含藥劑量增加蛋白表達而降低。bax基因蛋白的熒光指數(shù)（FI）分別為1.1559±0.0121、1.2396±0.0109、1.2989±0.0119，陰性對照組為1.0349±0.0190，5-FU組為1.261.1±0.0855；各組與陰性對照組相比均有顯著差異（P<0.01），且隨健脾丸劑量增加bax蛋白表達而增加。2．5免疫組化檢測中，因樣本含量較少不足以進行統(tǒng)計學(xué)分析，但經(jīng)組織形態(tài)學(xué)分析，中藥低、中、高劑量組細胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒說明bcl-2基因蛋白表達陽性，且可看到隨中藥劑量增加bcl-2表達逐漸減弱。中藥低、中、高劑量組細胞漿中亦出現(xiàn)棕黃色顆粒說明bax基因蛋白表達陽性，且隨中藥劑量增加bax表達逐漸增強。以上基因蛋白表達趨勢與流式定量分析所得結(jié)果相符。結(jié)論 ：1 健脾丸可抑制肝癌細胞的生長，與對照組比，各濃度組在24小時、48小時、72小時均能顯著抑制肝癌細胞SMMC-7721的生長。并且中藥的生長抑制作用呈劑量時間依賴性。本實驗結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)中藥健脾丸能抑制腫瘤細胞的生長。2 本實驗顯示：健脾丸低、中、高劑量組作用于腫瘤細胞后，G<,0>/G<,1>；期細胞比例增加，S期細胞比例減少，提示可將細胞阻滯于G<,0>/G<,1>；期，同時腫瘤細胞凋亡率也增加，與對照組相比有顯著差異。且中藥的凋亡率呈劑量依賴性。3 本實驗中，健脾丸低、中、高劑量組，bcl-2基因蛋白的表達隨劑量增加而降低，而bax基因蛋白的表達隨劑量增加而增加。提示：健脾丸可能通過降低凋亡抑制基因bcl-2表達，增加促凋亡基因bax表達而發(fā)揮抗肝癌作用。4 體內(nèi)實驗表明：中藥低、中、高劑量組與化療組相比均能明顯提高荷瘤小鼠脾指數(shù)，與化療組相比有顯著差異。說明健脾丸可能提高荷瘤小鼠機體免疫力。5 中醫(yī)健脾丸是治療脾虛的代表方劑，具有健脾消食，化濕除熱的作用，本實驗說明：健脾丸對肝癌細胞具有一定抑制作用，一定程度上支持中醫(yī)肝癌“本”是“脾虛”的觀點。