1.用脫脂奶粉封閉的效果不一定比用BSA差，不過(guò)我們?cè)囘^(guò)幾種奶粉，有一些奶粉不太適合。推薦使用的奶粉：雀巢高鈣奶粉，多力精低脂奶粉。一般國(guó)產(chǎn)的奶粉的顆粒比較大，不太容易溶解。

　　2.關(guān)于三名治：本人以前做時(shí)花很多時(shí)間在防止短路上，現(xiàn)在我做的時(shí)候根本沒(méi)有剪齊，最主要的是趕氣泡，這是關(guān)鍵的關(guān)鍵，其實(shí)轉(zhuǎn)膜的原理是電流的單向流動(dòng)，現(xiàn)在的好多公司的轉(zhuǎn)膜裝置的電極是一個(gè)平面，所以不用擔(dān)心短路的。（不信的可以試試?。。?/P>

　　3.關(guān)于轉(zhuǎn)膜時(shí)的溫度：轉(zhuǎn)膜時(shí)的溫度比較重要，最好保持在10度以下，可以用冰浴（Pharmacia的轉(zhuǎn)膜裝置），也可以在轉(zhuǎn)膜液中放入合適的事先準(zhǔn)備的冰袋（-70度>3小時(shí)）（Bio-Rad），這樣既可以降溫又可以節(jié)約Buffer. 4.關(guān)于轉(zhuǎn)膜電流和時(shí)間：一般轉(zhuǎn)膜的電流在200mA-400mA之間時(shí)間為1小時(shí)，大片段的>50KD的可以選用350mA，小片段的可以用250mA，不過(guò)本人覺(jué)得上述電流均能很好的把大部分蛋白轉(zhuǎn)過(guò)去。

　　5.關(guān)于反復(fù)標(biāo)記和再標(biāo)記：一張膜上可以同時(shí)標(biāo)記很多抗體，但要注意，一般在兩個(gè)目的蛋白相差在5KD以上的，最好先后兩個(gè)抗體是不同的二抗。在兩個(gè)目的片段相差小于5KD時(shí)，就需要經(jīng)過(guò)處理，再標(biāo)記了（Re-Blot），有些公司有再標(biāo)記的現(xiàn)成試劑，不過(guò)比較貴，最簡(jiǎn)單的方法是：ddH2O洗5分鐘，0.2MNaOH5分鐘，再用ddH2O5分鐘*3次，然后可以再標(biāo)記了。要做多個(gè)抗體的膜\的選擇，最好用PVDF或教堅(jiān)固的，推薦用Amsham的Hybond-P，Hybond-Extra.本人最多在一張膜上做個(gè)10個(gè)不同的抗體。